[发明专利]一种双壳贝类精子质量检测的方法

权利要求书

1.一种双壳贝类精子质量检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）精液制取：选择发育饱满的个体，解剖镜检，选出性腺发育好的雄性个体，用吸管吸取精子置于灭菌海水中；

（2）荧光染液配制：将PI和Rh123分别溶于超纯水中，储存；

（3）精液染色：取一定量精液，加入两种上述荧光染液混合，放置、离心，洗涤，重悬，再进行流式细胞仪检测；

（4）流式细胞仪检测结果：经PI/Rh123染色和FCM检测的精子分布在不同的象限：R1表示质膜破坏线粒体无活性的死精子，R2表示质膜破裂但线粒体仍具有活性，也就是即将死亡的精子，R3表示质膜正常但无线粒体跨膜电位的精子，R4为正常的活精子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，使用血球计数板调整精子浓度为10⁷~10⁸个/mL。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）具体为：将PI和Rh123分别溶于超纯水中，均配成浓度为1mg/mL的储存液，按照试剂储存要求，分别放于-20℃和-4℃保存。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）具体为：将上述两种储存液分别稀释至100μg/mL，取一定量精液，加入两种染液混合，使待测样品的染液终浓度均为10μg/mL，在室温下避光放置10~15min，离心，0.01M PBS，pH7.4冲洗，重复洗涤离心2次，PBS重悬，流式细胞仪检测。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，设置流式细胞仪参数：向前散射FSC与侧向散射SSC为线性放大，荧光通道FL1和FL2对数放大，测每个精子Rh123和PI的荧光强度，每份悬液检测8000~10000个精子。