[发明专利]一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合及方法

权利要求书

1.一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合，其特征在于：所述引物组合由SEQ ID NO：1～1354所示序列的多重PCR引物组成。

2.一种基于高通量测序平台检测α-地中海贫血基因突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)胚胎细胞全基因组扩增和夫妻双方全血DNA提取：将获自体外培养的囊胚的滋养层细胞经全基因组扩增对细胞中的基因组DNA进行富集，和全血DNA提取，得到DNA后进行浓度测定；

(2)目的片段扩增：将DNA与多重PCR引物和PCR扩增试剂混合，经多重PCR反应，得到目的基因DNA片段；

(3)引物消除：将步骤(2)得到的DNA片段与引物消除试剂混合反应，降解去除PCR扩增片段中的引物序列，得到去引物的DNA片段；

(4)接头连接：将步骤(3)得到的DNA片段与P1接头、特异性接头、连接反应试剂混合进行连接反应，得到加接头的DNA片段；

(5)磁珠纯化：将加接头的DNA片段进行磁珠纯化，去除多余的小片段接头，得到纯化的DNA片段；

(6)文库扩增：将步骤(5)的DNA片段加入文库扩增反应液及文库扩增引物进行PCR扩增，并采用磁珠进行纯化，得到小片段的DNA文库；

(7)文库检测：将步骤(6)得到的文库采用荧光定量PCR的方法检测文库浓度；

(8)高通量测序：采用Ion Proton或Ion PGM测序平台对步骤(7)得到的文库进行高通量测序；

(9)生物信息学分析：对胚胎活检细胞全基因组扩增WGA产物(DNA)及家系样本进行捕获测序进行生物信息学SNP分析，获得夫妇及致病基因连锁单倍型信息，再根据胚胎样本的测序信息判断是否遗传了父母亲的致病单体型。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述的多重PCR反应条件如下：

99℃预变性2min，1个循环；99℃变性15sec，60℃退火和延伸4min，22个循环；10℃终止。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述的P1接头如下：

5’-CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT-3’和

5’-ATCACCGACTGCCCATAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT-3’；

所述特异性接头是由如下正反两个序列组成的Barcode x：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT-3’和5’-ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC-3’，Barcode x代表的具体序列如下：

Barcode 1：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTAAGGTAACGAT-3’

5’-ATCGTTACCTTAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 2：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAAGGAGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCTCCTTACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 3：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAAGAGGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCCTCTTCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 4：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTACCAAGATCGAT-3’

5’-ATCGATCTTGGTACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 5：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGAAGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCTTCTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 6：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGCAAGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACTTCTTGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 7：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGTGATTCGAT-3’

5’-ATCGAATCACGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 8：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCCGATAACGAT-3’

5’-ATCGTTATCGGAACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 9：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGAGCGGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCCGCTCACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 10：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCTGACCGAACGAT-3’

5’-ATCGTTCGGTCAGCTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 11：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCCTCGAATCGAT-3’

5’-ATCGATTCGAGGACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 12：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTAGGTGGTTCGAT-3’

5’-ATCGAACCACCTACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 13：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAACGGACGAT-3’

5’-ATCGTCCGTTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 14：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTGGAGTGTCGAT-3’

5’-ATCGACACTCCAACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 15：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTAGAGGTCGAT-3’

5’-ATCGACCTCTAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’；

Barcode 16：

5’-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTGGATGACGAT-3’

5’-ATCGTCATCCAGACTGAGTCGGAGACACGC-3’。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)中所述的PCR扩增反应条件如下：

98℃预变性2min，1个循环；98℃变性15sec，60℃退火和延伸1min，5～7个循环；10℃终止。