[发明专利]一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及其应用。通过乙烷基亚硝基脲(ENU)诱变青鳉单倍体胚胎干细胞(HX1细胞)，进而筛选得到抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞G1。所述抗赤点石斑鱼神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞G1于2018年1月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201832。为进一步鉴定参与病毒感染的宿主因子提供了实验和理论基础，并为抗病毒鱼的遗传育种提供了新途径。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗鱼类神经坏死病毒青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法及其应用。

背景技术

单倍体细胞只具有一套染色体，没有等位基因的存在，细胞中每个基因均只有一个，且每个基因均能发挥自己的作用，因此单倍体细胞是研究基因功能的良好材料。目前单倍体细胞已经在基因筛选鉴定、病原学、动物育种和转基因动物等方面得到广泛的应用。例如，通过对人类单倍体细胞进行深度基因插入突变，成功鉴定粘多糖与裂谷热病毒感染密切相关。通过对人类单倍体细胞进行全基因组功能缺失筛选实验，成功鉴定一系列与汉坦病毒膜融合相关的宿主因子。

单倍体胚胎干细胞(HaESC)同时具有单倍体细胞和胚胎干细胞的特性，因此更是研究基因功能的理想模型，具有巨大的应用潜力。目前，多个物种的HaESC已被成功建立，包括青鳉、猴、大鼠和人等。HaESC的最大优势是可以大范围筛选隐性基因，在正反向遗传学的研究中起到了重要作用，一方面可以通过基因打靶、CRISPR-Cas9技术等方式敲除或敲入基因，让部分基因功能缺失，通过表型改变来研究目的基因的功能和作用。另一方面，通过化学诱导对基因组进行大规模突变，快速地建立涵盖整个基因组的基因突变细胞库，形成可遗传的突变表型，进而深度挖掘该表型对应的基因，最终揭示该表型的形成机制。

乙烷基亚硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)是一种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ENU能不依赖于任何代谢过程，而通过烷化反应将其乙烷基加入DNA碱基的部分基团，从而引起碱基配对错误。利用ENU可在较短时间内诱导生物体产生大量随机突变表型，筛选获得具有特殊表型的动物或细胞模型后，可以定位克隆突变基因，联系表型特征进而推测相应基因的功能。目前ENU已被广泛应用于基因功能的研究。

鱼类神经坏死病毒是一种单股正链RNA病毒，隶属于诺达病毒科(Nodaviridae)家族。该病毒引发的鱼类神经坏死病是一种世界范围内流行的鱼类传染性疾病，至今已有120多种鱼类被该病毒感染，被感染鱼类的死亡率高达50-100％，对世界水产养殖业造成巨大经济损失。然而，目前对该病毒的致病机制尚不清楚，特别是与该病毒感染直接相关的宿主基因尚不清楚。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗赤点石斑鱼神经坏死病毒(RGNNV)青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法，通过ENU诱变青鳉单倍体胚胎干细胞(HX1细胞)，进而筛选得到抗RGNNV青鳉单倍体胚胎干细胞G1。本发明的另一目的是提供抗RGNNV青鳉单倍体胚胎干细胞G1在抗病毒鱼的遗传育种领域的应用。

本发明的技术方案为：

一种抗RGNNV青鳉单倍体胚胎干细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)青鳉单倍体胚胎干细胞传代培养：将HX1细胞在ESM4培养基中培养，加入蛋白补充剂，细胞用胰蛋白酶消化后传至铺有明胶的6孔细胞培养板，放置于28℃培养箱中培养24h；

(2)ENU诱变：在培养基中加入浓度为10uM的O⁶-BG预处理24h，然后去掉培养基，更换为ENU终浓度为10mg/ml的ESM4培养基，继续培养48h，将诱变后的HX1细胞接种于24孔细胞培养板，每孔3×10⁴细胞，置于28℃培养箱培养24h；