[发明专利]重组枯草芽孢杆菌及其过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法

说明书

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌，在重组枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，进一步过表达6‑磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），得到重组菌BSGNKS；所述重组枯草芽孢杆菌BSGNK，是以B. subtilis 168 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagA Δ nagB Δ ldh Δ pta Δ glck::lox72为宿主，分别以启动子P_xylA、P₄₃控制glms、GNA1的重组表达；还公开了重组枯草芽孢杆菌过表达6‑磷酸氨基葡萄糖合成酶促进乙酰氨基葡萄糖合成的方法，得到的重组枯草芽孢杆菌可提高乙酰氨基葡萄糖在胞外积累和底物的转化效率，发酵上清液中乙酰氨基葡萄糖含量为11.4 g/L，与对照菌BSGNK相比分别提高了37.4%，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础，且重组枯草芽孢杆菌构建方法简单，便于推广使用。

技术领域

本发明涉及遗传工程领域，尤其涉及一种能够提高乙酰氨基葡萄糖产量的重组枯草芽孢杆菌，还涉及利用该重组枯草芽孢杆菌过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶促进合成乙酰氨基葡萄糖的方法。

背景技术

乙酰氨基葡萄糖是生物体内的一种单糖，广泛存在于细菌、酵母、霉菌、植物以及动物体内。在人体中，乙酰氨基葡萄糖是糖胺聚糖二糖单元的合成前体，其对修复和维持软骨及关节组织功能具有重要作用。因此，乙酰氨基葡萄糖被广泛作为药物和营养膳食添加来治疗和修复关节损伤。此外，乙酰氨基葡萄糖在化妆品和制药领域也具有诸多应用。目前，乙酰氨基葡萄糖主要采用酸解虾壳或蟹壳中甲壳素生产，此方法产生的废液对环境污染较为严重，而且得到的产品易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被 FDA 认证为“generally regarded as safe”(GRAS) 安全级别。以往构建的重组枯草芽孢杆菌（BSGNK）发酵生产乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）时，存在GlcNAc产量低的问题。在B. subtilis中，葡萄糖首先在葡萄糖激酶和磷酸葡萄糖异构酶作用下合成6-磷酸果糖，随后在6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS）催化作用下合成6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-6P），再在6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶（GNA1）的作用下生成6-磷酸乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc-6P），最后在脱磷酸生成GlcNAc被转运至胞外。但有研究表明，6-磷酸果糖在GlmS的催化作用下生成6-磷酸氨基葡萄糖（GlcN-6P）的过程受到由glmS核酶开关介导的严格反馈控制，具体过程如下：当胞内GlcN-6P积累时，其能够与glmS核酶开关结合，激活核酶开关对glmS基因转录产物进行自切割；3’端mRNA切割部分因切割形成的5’-OH端被RNA酶J1特异性识别，在RNA酶J1作用下mRNA被进一步降解，造成glmS基因的mRNA无法翻译，降低glmS基因的表达；而当GlcN6P浓度较低时，glmS基因转录产物可正常翻译。因此，要想过量合成GlcNAc，必须解除glmS核酶对GlcNAc合成关键酶GlmS在转录水平的抑制调控。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种通过强组成型启动子P₄₃过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），解除glmS核酶对GlcNAc合成关键酶GlmS在转录水平的抑制调控，避免了glmS基因的mRNA被RNA酶降解，使得glmS基因的mRNA正常翻译，促进了胞外乙酰氨基葡萄糖积累的重组枯草芽孢杆菌。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：重组枯草芽孢杆菌，在重组枯草芽孢杆菌BSGNK的基础上，进一步过表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶（GlmS），得到重组菌BSGNKS；所述重组枯草芽孢杆菌BSGNK，是以B. subtilis 168 Δ nagP Δ gamP Δ gamA Δ nagAΔ nagB Δ ldh Δ pta Δ glck :: lox72为宿主，分别以启动子P_xylA、P₄₃控制glms、GNA1的重组表达。