[发明专利]一种构建Ribo-seq测序文库的方法

说明书

本发明公开了一种构建Ribo‑seq测序文库的方法。所述方法包首先分离核糖体‑新生肽链复合物(Ribosome‑nascent chain Complex,RNC)，再对RNC进行酶切，不进行rRNA去除而直接建库，通过选择RPF条带而对RPF进行测序。由于无需去除rRNA，也就无需昂贵的rRNA去除试剂盒，同时也可以应对任何物种，适用范围广，RPF reads比例高于传统方法，降低了通量需求，从而降低了测序成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种构建Ribo-seq测序文库的方法及其构建的测序文库。

背景技术

Ribosome profiling(又称Ribo-seq，“核糖体谱”或“核糖体分布谱”)技术是通过二代测序方法分析每个核糖体在mRNA上位置的方法。该方法使用核酸酶降解未被核糖体覆盖的mRNA片段，再将核糖体除去，用二代测序测定被核糖体覆盖的片段(Ribosomeprotected fragments，RPF)。由于每个RPF对应一个核糖体，因此将这些RPF比对到参考序列后即可得知翻译中每个核糖体的位置，从而从全局上研究翻译。

虽然这项技术可以使人们从全局上研究翻译，但此项技术存在可控性差、成本极为高昂等问题。目前，所有的Ribosome profiling分析基本按照PMID:22836135的方法进行，裂解细胞，在细胞裂解液中进行酶切，再通过蔗糖密度梯度离心分离单核糖体组分，提取RNA，去除核糖体RNA(rRNA)，再将剩余的RPF进行建库测序分析。这一流程存在的主要问题在于：(1)细胞裂解液中核糖核酸酶(RNase)不受控制，酶切难以控制，常有酶切过度或不足问题，不同条件下的酶切条件难以统一，从而造成结果的不可比；(2)去除rRNA的试剂盒十分昂贵，并且存在种属限制，尤其是对于大量非模式物种，专门进行定制更是昂贵；(3)由于去除rRNA的探针是针对完整的rRNA设计的，而酶切也会切断rRNA，因此往往导致去除rRNA效果不佳，测序结果中85％以上的reads是rRNA，这对翻译研究毫无作用，造成了巨大的通量浪费，也使得测序成本极为高昂。

为解决以上问题，本发明首先分离核糖体-新生肽链复合物(Ribosome-nascentchain Complex,RNC)，再对RNC进行酶切，不进行rRNA去除而直接建库，通过选择RPF条带而对RPF进行测序。由于首先提取了RNC，脱离了细胞裂解液中难以控制的RNase，条件单一，因此所有物种几乎都可以用同样的方法进行酶切。而RNC的提取可从动物细胞(如Wang etal.,Nucleic Acids Research 2013、专利文献CN104186460A中所述)、动物组织(如专利文献CN104262478A中所述)、细菌(如Chen et al.,Journal of Biotechnology 2014,189(10),104-113)、植物组织(如专利文献CN104961813A中所述)中提取，因此适用面非常广泛。由于无需去除rRNA，也就无需昂贵的rRNA去除试剂盒，同时也可以应对任何物种。RPFreads比例高于传统方法，降低了通量需求，从而降低了测序成本。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种构建Ribo-seq测序文库的方法。利用该方法可以无需去除rRNA直接建库，同时避免细胞内small RNA以及非翻译RNA的污染，简化操作流程，适用性大，无需根据不同物种合成rRNA捕获试剂，大幅降低构建Ribo-seq文库的成本，同时能得到质量好的RPF测序数据，可以有效克服当前方法测序成本过高、操作复杂以及适用性局限于几个物种等技术缺陷。

本发明还提供一种上述方法构建的Ribo-seq测序文库。

具体地，所述构建Ribo-seq测序文库的方法包括以下步骤：

(1)提取待测样品的核糖体新生肽链复合物(RNC)；

(2)对步骤(1)中得到的RNC进行处理，得到核糖体包裹的mRNA(RPF-RNA)片段；