[发明专利]用于二倍体D基因组棉种或四倍体棉种鉴定的引物及方法

说明书

本发明公开了一种用于二倍体D基因组棉种或四倍体棉种鉴定的引物及方法，引物du01的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，引物du01的反向引物序列如SEQ ID No.2所示。本发明的特异性引物du01能在以二倍体D基因组棉种或四倍体棉种为模版的PCR中扩增出特异性的750bp的核苷酸序列。而在以A、B、C、E、F、G、K组的10个二倍体棉种为模版的PCR中无产物，因此能快速鉴定包含D(亚)基因组棉种，解决实验工作中意外将D(亚)基因组棉种与其他棉种DNA混淆问题，具有重要实用价值。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一对适用于棉花二倍体D基因组棉种及四倍体棉种鉴定的特异引物du01，及其PCR鉴定方法。

背景技术

Polymerase Chain Reaction(PCR)，聚合酶链式反应，是一种依靠特定引物识别互补位点，依靠DNA聚合酶催化，依据DNA复制原理，扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，是一种在生物体外的人们可控的特殊DNA复制过程。PCR的用途是，能将少量的DNA成千上万倍复制增加。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

棉花是世界上重要的经济作物，棉属共有52个棉种，包括5个四倍体和47个二倍体。根据染色体形态和进化关系，棉花二倍体分为A、B、C、D、E、F、G和K基因组。四倍体棉种为二倍体A组棉种和二倍体D组棉种杂交形成的异源四倍体，其染色体组为AADD。人们主要种植的产纤维的棉花是四倍体棉中的陆地棉(AD)₁和海岛棉(AD)₂。A基因组和D基因组是科研工作者的主要和常用研究对象，但是在实际实验中，我们常常遇到两个甚至多个基因组棉种的组织或DNA混淆或其他原因想快速鉴别开来的情况。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速便捷鉴别二倍体D组棉种或四倍体棉种的方法。

本发明的技术方案为：用于二倍体D基因组棉种或四倍体棉种鉴定的引物du01，引物du01的正向引物序列如SEQ ID No.1所示，引物du01的反向引物序列如SEQ ID No.2所示。

引物du01在二倍体D基因组棉种或四倍体棉种鉴定上的应用。

用于二倍体D基因组棉种或四倍体棉种鉴定的试剂盒，包含有权利要求1所述的引物du01。

一种鉴定棉花二倍体D基因组棉种或四倍体棉种的方法，包括以下步骤：

(1)使用引物du01，以待测棉种的核基因组全部DNA为模板进行PCR扩增；

(2)PCR扩增产物做电泳检测；如果得到一条750bp的目的产物，则待测棉种为棉花二倍体D基因组棉种和/或四倍体棉种。

进一步地，PCR扩增体系为：du01正向引物和反向引物各0.5μL，总DNA4μL，2×TaqMix 5μL；反应体系为10μL；PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；58℃退火35秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃保持5分钟，10℃存放。