[发明专利]一种直扩RPA现场可视化检测方法

权利要求书

1.一种直扩RPA现场可视化检测方法，包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组DNA；

2)针对目的基因设计用于RPA检测的特异性引物，所述特异性引物包括外引物F和内引物R；

3)将步骤1)粗提的基因组DNA作为模板，步骤2)设计的RPA特异性引物加入到RPA反应体系中，进行RPA扩增反应；

所述RPA反应体系包含外引物F、内引物R、dNTPs、MgOAc、模板DNA，成分的终浓度为：外引物F 0.12-0.48μM，内引物R 0.12-0.48μM，dNTPs 1.4-1.8mM，MgOAc 8.4-14mM，模板DNA1～2μL；RPA扩增反应程序为：32-42℃，5-10min；RPA扩增反应程序中反应温度优选36-42℃；

4)鉴定扩增结果

步骤3)RPA扩增反应结束后，向扩增产物中加入SYBR Green I染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性；显色为橘色的样品为阴性。

2.根据权利要求1所述的直扩RPA现场可视化检测方法，其特征在于，步骤1)中，粗提待测样品基因组DNA的方法为：向待测样品中加入粗提试剂lysis buffer对待测样品进行5～10倍稀释，混匀，室温放置1min以上，即可作为模板DNA使用；

所述粗提试剂lysis buffer包含NaOH、Na₂EDTA，NaOH与Na₂EDTA的物质的量浓度之比为48～52：1。

3.一种用于直扩RPA方法检测转基因玉米TC1507的RPA特异性引物，包括外引物F和内引物R，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物F：AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；

内引物R：TGACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC。

4.一种检测转基因玉米TC1507的直扩RPA现场可视化检测方法，包括如下步骤：

1)粗提待测样品基因组DNA；

2)设计RPA特异性引物

RPA特异性引物包括外引物F和内引物R，具体序列如下：

外引物F：AAAAGTGCGACAAAAGCCTCCAAGCGAGTATT；

内引物R：TGACTTAATCGCACCCATCAGGCCTTTGCAGC；

3)RPA扩增反应；

所述RPA反应体系中成分的终浓度为：外引物F 0.12-0.48μM，内引物R 0.12-0.48μM，dNTPs 1.4-1.8mM，MgOAc 8.4-14mM，模板DNA 1～2μL；RPA扩增反应程序为：32-42℃，5-10min；RPA扩增反应程序中反应温度优选36-42℃；

4)鉴定扩增结果

步骤3)RPA扩增反应结束后，向扩增产物中加入SYBR Green I染料，直接在日光灯或者阳光下观察颜色变化：显色为绿色的样品为阳性，含有转基因玉米TC1507基因组DNA；显色为橘色的样品为阴性，不含有转基因玉米TC1507基因组DNA。

5.根据权利要求4所述的直扩RPA现场可视化检测方法，其特征在于，步骤1)粗提待测样品基因组DNA的方法为：向待测样品中加入粗提试剂lysis buffer，混匀，室温放置1min以上，即可作为模板DNA使用；

待测样品与粗提试剂lysis buffer的质量体积比为：0.5～1：1×10⁴，单位：g/μL；

所述粗提试剂lysis buffer包含NaOH、Na₂EDTA，NaOH与Na₂EDTA的物质的量浓度之比为：48～52：1。

6.一种用于直扩RPA方法检测金黄色葡萄球菌的RPA特异性引物，包括外引物F和内引物R，具体序列如下，从5’端到3’端：

外引物F：ATGAATCAGCTCCACAGAGTACAGATGCAAGTA；

内引物R：CTCCAGAGTCAATACCAACTGTCACATTCGTCA。