[发明专利]一种可直接用于高通量测序的植物细胞器DNA提取方法

说明书

本发明公开了一种可直接用于高通量测序的植物细胞器DNA提取方法。首先配置GM1（含BSA，PVP，β‑巯基乙醇），GM2（含BSA，β‑巯基乙醇），GM3（含BSA）；然后将将新鲜植物材料进行预处理后，加入GM1研磨缓冲液，研磨过滤后收集滤液，对滤液进行离心，得到线粒体与叶绿体的粗提物；加入GM2进行悬浮后，清洗，离心得到较纯的线粒体与叶绿体；加入GM3悬浮后，加入DNaseⅠ降解核DNA，离心后收集线粒体与叶绿体，使用试剂盒提取细胞器DNA。本发明能够快速获得可以用于二代或三代测序的植物细胞器DNA。

技术领域

本发明属于生物技术领域，介绍了一种利用植物组织提取细胞器DNA，且获得的DNA可用于二代或三代基因组测序的方法。

背景技术

DNA是植物的遗传物质，在形式上具有三种，分别是核DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA，其中线粒体DNA及叶绿体DNA统称为细胞器DNA。

线粒体作为细胞能量代谢和物质转化的中枢，在细胞合成、物质转运及信息传递中起着重要作用。另外，对许多高等植物细胞质雄性不育研究表明，线粒体与细胞质雄性不育有密切关系，是雄性不育因子的重要载体。研究线粒体的结构与功能，对作物改良，探索细胞器的起源和进化，特别在植物细胞质雄性不育的研究、不同雄性不育的细胞质分类上有重要的意义。

叶绿体是与光合作用直接相关的细胞器，其基因组的功能也跟光合作用密不可分，一般认为叶绿体是由蓝细菌通过内共生起源的。叶绿体作为植物细胞中一个独立的细胞器，拥有自己的一套完整的基因组。它在在裸子植物中一般为父系遗传，而在被子植物中多为母系遗传。研究叶绿体的结构与功能对作物改良、探索叶绿体的起源与进化、被子植物系统演化具有极其重要的意义。

提取高质量的细胞器DNA是对线粒体、叶绿体基因组进行测序的基础，是对遗传系统进行深入研究的基本前提。植物细胞器DNA与核相比，在细胞内含量甚微。另外，植物大多数为环状分子，每个线粒体中分子数从几拷贝到几十拷贝不等，且不同物种分子大小差别很大，从几十到几千不等，所对应的提取方法也不同。总体来看，植物提取方法，主要有密度梯度离心和差速离心等方法。得到的细胞器DNA纯度高，但操作复杂、耗时、对材料的需求量大、产率低，但得到产物相对较少，且易降解，易受到核、蛋白质等杂质污染。这些不利因素的制约导致现有的线粒体提取方法不能满足后续研究工作的需要，因此，有必要开展对细胞器DNA新提取方法的探索研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用植物组织提取细胞器DNA，且获得的DNA可用于二代或三代基因组测序的方法。

为达到上述目的所采用的技术方案如下：

1.缓冲液配置：

GM1缓冲液：0.5M蔗糖，0.001M EDTA，0.1M KH₂PO₄，1％BSA，0.5％PVP，1％β-巯基乙醇，pH 7.5；

GM2缓冲液：0.5M蔗糖，0.001M EDTA，0.1M KH₂PO₄，1％BSA，1％β-巯基乙醇，pH7.5；

GM3缓冲液：0.5M蔗糖，0.001M EDTA，0.1M KH₂PO₄，1％BSA，pH 7.5；

2.材料预处理：

取新鲜植物材料清洗后在4℃预冷1h；以下步骤除DNA提取外均在4℃进行。

3.破碎细胞：

将步骤(2)中的材料放置于粉碎机中，加入步骤(1)中的GM1，打磨2min；8层纱布过滤，获得上清液；

4.分离细胞器：