[发明专利]亚硝化菌的保藏方法

说明书

本发明公开了一种亚硝化菌的保藏方法，包括以下步骤：1)配置保护剂：在90～120份无菌水中加入2～4份谷氨酸钠、18～25份磷酸三钾和1～3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂；2)加入菌体：在步骤1)得到的保护剂中加入0.8～1.2倍体积亚硝化菌菌体，震荡重悬，得到混合液；3)冷冻保藏：将步骤2)得到的混合液冷冻干燥，于‑70～‑90℃下冷冻保藏，每隔2～3个月进行活化转接。有益效果：可大幅减小冷冻干燥对亚硝化菌菌体的损伤，提高保藏过程中亚硝化菌存活率和ATP酶、氨单加氧酶(AMO)的活性。

技术领域

本发明涉及菌种保藏技术领域，具体是一种亚硝化菌的保藏方法。

背景技术

氨氮首先在亚硝化菌作用下转化为亚硝酸盐,然后在硝化菌作用下亚硝酸盐进一步转化为硝酸盐。硝化反应的总反应式为：NH₄⁺+1.815O₂+0.1304CO₂→0.0261C₅H₇O₂+0.973NO₃^--N+0.921H₂O+1.973H⁺。亚硝化菌氮循环的氧化代谢途径主要包括氨(NH₃)通过氨单加氧酶(AMO)氧化为羟胺(NH₂0H)，羟胺在羟胺还原酶(HAO)催化作用下继续氧化为亚硝酸根。亚硝酸细菌在自然界中的分布普遍,土壤、海洋及淡水中都有亚硝酸细菌的存在,且只占其中细菌总量的极小的比例。不同种属的亚硝酸细菌所分布的环境也不同。如欧洲亚硝酸菌广泛分布于土壤、污水、新鲜水及海洋中；白里亚硝酸螺旋菌主要分布于土壤中；而海洋亚硝酸球菌只在海洋中存在。亚硝酸细菌的生长极为缓慢，在适宜的条件下需24h才能完成一次分裂周期。在进行固体培养的过程中一般需数月才能见到菌落生长。

冷冻干燥技术是众多菌种保藏方法中在理想的方法之一，但是冻干对亚硝化菌细胞会造成一定的生理损伤，降低细胞存活率，主要表现在冻结过程中冰晶的机械损伤、冻结及干燥过程中引起的溶质损伤、冷冻干燥前后细胞膜的结构、功能及成分的变化、关键酶失活、DNA结构的变化等。

(1)机械损伤:在干燥前，要将菌体进行冻结，在冻结的过程中，细胞内大量的水会形成冰晶，冰晶引起细胞膜的破裂，对细胞膜系统造成的机械损伤，导致膜结构的破坏，从而影响细胞正常的生理代谢功能；

(2)溶质损伤:对于细胞来说其体积很小、比表面积很大、细胞膜的水渗透率很高，温度降低时细胞内水分含量下降，胞外和胞内的电解质浓缩，细胞过度脱水、严重皱缩；这些都导致细胞的损伤以至死亡；这种损伤被称为“溶液损伤”或“溶质损伤”；

(3)细胞膜的结构及成分的变化:冷冻干燥是一个强烈的胁迫过程，在这个过程中必然造成细胞膜脂类物质的物理状态变化。细胞膜磷脂为双分子层，膜的两端为极性端，其在一定程度上是以水合形式存在的，每个磷脂的极性端之间被水隔开。当冷冻干燥脱水时，磷脂极性端除去水合氢键，迫使酰基集聚在一起，极性端密度变大，分子间范德华力增加，液晶相脂膜转变凝胶相，这种结构变化导致了细胞膜渗透性增加，使得细胞无法控制胞内外物质的双向交换，从而造成细胞的代谢损伤。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可大幅减小冷冻干燥对亚硝化菌菌体的损伤，提高亚硝化菌存活率和ATP酶、氨单加氧酶(AMO)的活性的亚硝化菌的保藏方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：亚硝化菌的保藏方法，包括以下步骤：

1)配置保护剂：在90～120份无菌水中加入2～4份谷氨酸钠、18～25份磷酸三钾和1～3份半胱氨酸，混合均匀得到保护剂；

2)加入菌体：在步骤1)得到的保护剂中加入0.8～1.2倍体积亚硝化菌菌体，震荡重悬，得到混合液；