[发明专利]Sirtuin 1经Bmi1介导调控老年性牙槽骨丢失作用机制的研究方法

权利要求书

1.Sirtuin 1经Bmi1介导调控老年性牙槽骨丢失作用机制的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.实验动物培育及基因型鉴定，选用分别带有WT、Sirt1TG、Bmi1KO、Sirt1TG/Bmi1KO基因的小鼠；

b.牙槽骨表型分析相关指标检测；

c.小鼠颌骨M-MSCs培养和体外实验；

d.氧化应激相关指标检测；

e.Sirt1激活剂处理自然衰老小鼠；

f.临床牙槽骨样本采集、颌骨M-MSCs培养及用Sirt1激活剂处理；

所述研究方法分别从整体、细胞与分子水平出发，系统研究Sirt1在调控老年性牙槽骨丢失中的作用及机制，包括：

1)分别比较3、9和18月龄MSC过表达Sirt1的转基因(Sirt1TG)小鼠与同窝野生型(WT)小鼠下颌牙槽骨的表型差异，观察MSC过表达Sirt1能否防止老年性牙槽骨丢失；

2)通过建立MSC过表达Sirt1的Bmi1KO(Sirt1TG/Bmi1KO)小鼠模型，比较它们与Sirt1TG小鼠下颌牙槽骨的表型差异，观察Bmi1基因缺失能否阻断Sirt1过表达所引起的牙槽骨量增加；

3)培养WT和Sirt1TG小鼠颌骨来源的MSCs(M-MSCs)，并用Sirt1激活剂及抑制剂或RNA干扰特异性敲低Sirt1处理，检测Bmi1乙酰化水平、Bmi1核转位及其下游靶标分子表达水平的变化，同时检测MSC增殖、分化、凋亡和衰老相关指标的变化，观察Sirt1是否通过去乙酰化Bmi1而促进其核转位，抑制p16/p19和p53-ROS信号通路，促进MSC增殖和向成骨细胞分化，抑制其凋亡和衰老；

4)将用Sirt1的激活剂白黎芦醇分别处理16月龄自然衰老WT小鼠及≥60岁老龄人群的M-MSCs，观察上调Sirt1在治疗牙槽骨丢失中的作用。

2.根据权利要求1所述的Sirtuin 1经Bmi1介导调控老年性牙槽骨丢失作用机制的研究方法，其特征在于，所述步骤b包括以下子步骤：

1)取材：小鼠麻醉后脱颈取下颌骨，使用能更好保存酶活性和组织抗性的PLP固定液固定，用于X-线摄影、微-CT扫描和三维重建；经脱钙、脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片，用于HE、组化和免疫组化及TUNEL染色；取新鲜牙槽骨组织，提取RNA用于Real-time RT-PCR检测；提取蛋白质用于Western blot分析；

2)X-线摄影、微-CT扫描和三维重建：固定后的下颌骨进行X线摄影，观察牙槽骨形态和密度的改变；使用先前报道的方法进行微-CT扫描和三维重建观察牙槽骨丢失和矿化程度的改变；

3)组织化学染色：进行HE、总胶原、碱性磷酸酶(ALP)染色、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色；

4)免疫组织化学染色：取下颌骨的石蜡切片，进行免疫组织化学染色；检测指标包括成骨细胞分化指标：I型胶原(Col I)、骨钙素(OCN)；破骨细胞分化指标：核因子κB受体活化因子配体(RANKL)；

5)Real-time RT-PCR：取下颌牙槽骨组织提取的RNA，做Real-time RT-PCR分析，观察骨分化相关基因表达的变化，检测指标如下：核心结合因子(Runx2)；

6)Western blot：取牙槽骨组织提取的蛋白质，进行Western blot分析，成骨相关检测指标：Runx2、OCN、骨桥蛋白(OPN)；

7)流式细胞分析：获得牙槽骨组织单细胞悬液用于流式细胞分析；处死小鼠24小时前，腹腔注射100mg BrdU/kg体重；取牙槽骨组织并用3mg/mL I型胶原酶和4mg/mL II型中性蛋白酶于37℃消化60分钟，获得单细胞悬液；用PBS+1％BSA调整细胞浓度为1×10⁶个/100ul，加入不同荧光标记的抗体，4度避光染30分钟，用1mlPBS+1％BSA洗涤细胞两次后，流式细胞仪检测。