[发明专利]一种人HLA-B*5801基因型的试剂盒及方法

说明书

本发明提供一种快速检测人HLA‑B*5801基因型的试剂盒及检测方法，所述试剂盒主要包括：通用引物、通用荧光探针和连接探针，以及连接反应及聚合反应混合液，酶混合液，阴性对照和阳性对照，本发明特点为通过一种新型的耐热连接酶反应控制单核苷酸多态性位点的特异性，只有匹配连接探针的核苷酸才能完成连接反应，并启动下一步聚合酶链式反应，并可通过通用荧光探针检测到HLA‑B*5801基因型，如果不匹配，则无法完成连接，反应终止，所有的检测过程可在同一个反应体系中完成，相对传统方法对于HLA‑B*5801基因型检测具有更好的特异性和敏感度。

(一)技术领域

本发明涉及一种快速检测人HLA-B*5801基因的PCR的试剂盒，以及检测人HLA-B*5801基因的方法，属基因诊断领域。

(二)背景技术

别嘌呤醇是一种次黄嘌呤氧化酶抑制剂，能够减少尿酸合成并降低血中尿酸浓度，是治疗痛风的首选药物。临床用于治疗：高尿酸血症；慢性痛风患者；痛风石尿酸性肾结石或尿酸性肾病。但该药易引起严重的皮肤不良反应，包括较轻微的药疹，及严重的剥落性皮炎、中毒性表皮坏死松解症等，有较高的致死率。

人类白细胞抗原(HLA)是1组位于第6号染色体上的基因，是迄今已知基因中等位基因多态性最高的基因复合体，是人类最复杂的遗传多态系统，其分布存在明显的种群特性。1989年，Chan等首次报道了HLA与别嘌呤醇引起不良反应相关性的研究，结果显示中国南方人群中，A*33和B*58为此类不良反应的高风险因素。2005年，Hung等进一步发现别嘌呤醇引起严重皮肤不良反应的患者中全部携带B*5801位点，而在未出现不良反应的患者中其携带率仅10％。由于中国汉族人、泰国人、韩国人的HLA-B*5801基因阳性率远高于白人(高达15％)，因此以上人种使用别嘌呤醇药物前需检测HLA-B*5801基因是否携带，避免患者误用别嘌呤醇而诱发严重副反应的风险。

目前用于HLA-B*5801基因检测的方法主要有以下几种：

(1)PCR-SBT法:即直接测序法；其可直接获得DNA序列，鉴定所有存在的多态性，为最直接、最直观的方法；但是，由于目的基因序列的特殊性、引物设计等多种因素，测序结果会出现套峰，不利于结果的判读，使得PCR-SBT法存在着模棱两可的结果，必要时需要人工判读碱基序列(Adams Et Al.,2004)，且测序技术需要用到造价昂贵的测序仪，医院内通常不会配备；

(2)PCR-SSP法:即序列特异性引物法；其根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的或组特异性的引物，此即为序列特异性引物；所述SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的；所述PCR-SSP法也是临床上使用最普及的方法。但此种方法操作复杂，耗时较长，且易发生污染，每批次操作差异较大，无法进行稳定快速的批量化操作。

(三)发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种快速检测人HLA-B*5801基因型的试剂盒及方法。

本发明采用的技术方案是：

一种人HLA-B*5801基因型的试剂盒，所述试剂盒由通用引物、通用荧光探针和连接探针，以及连接反应及聚合反应试剂(酶buffer、dNTP等)，酶混合液，阴性对照和阳性对照组成；

所述通用引物序列如下：

上游引物：5’-GACTCCAATCGAGCATGCAAAC-3’

下游引物：5’-TTCGGAACTATTGTCATGGTCCAA-3’

通用荧光探针序列如下：

5’-FAM-CTGCTGGACCCAGCACCGTACCA-BHQ1-3’；

连接探针1序列如下：