[发明专利]一种黑叶猴羊膜干细胞鉴定方法及其应用

说明书

本发明具体公开了一种黑叶猴羊膜干细胞分离鉴定方法，包括以下步骤：S1.物理机械分离；S2.消化分离；S3.过滤收集；S4.传代培养。通过本发明的方法获得的羊膜干细胞，通过Trypsin和Tryp LE处理，实验结果显示Trypsin和Tryp LE都可以从羊膜上皮层消化分离出羊膜上皮细胞。Trypsin消化所获得的细胞比Tryp LE消化所获得的细胞数要多，但是Trypsin消化分离的死细胞数量也比Tryp LE消化分离的死细胞也多。

技术领域

本发明涉及干细胞分离鉴定技术领域，具体地，涉及一种黑叶猴羊膜干细胞鉴定方法及其应用。

背景技术

干细胞(stem cells,SC)具有多能性和可再生性，是再生组织和器官的潜能性细胞，可以广泛地应用于细胞替代治疗、组织工程医学、生殖医学和药物筛选等多个领域。羊膜是羊膜动物胎盘内层的结构，羊膜腔提供胚胎生长发育的环境。2005年Miki等研究发现羊膜干细胞和胚胎干细胞非常相似，不仅表达胚胎干细胞表面抗原，而且还具有全能性。羊膜表面的上皮细胞层起源于外胚层细胞，因此人的羊膜上皮细胞更接近于人胚胎干细胞。羊膜上皮细胞除了表达人胚胎干细胞标志性抗原外，其分化能力也与人胚胎干细胞接近。羊膜干细胞具有低免疫原性和不形成畸胎瘤的特点，因而它在未来的再生医学中比胚胎干细胞更有优势。羊膜干细胞分离简单、容易、廉价，因此，羊膜干细胞也成了兽医学领域再生医学和细胞替代疗法的最重要也是最有前途的细胞来源。

到目前为止，已经成功分离获得动物羊膜干细胞的有绵羊羊膜和羊水干细胞、猪羊水干细胞、马羊水干细胞、水牛羊水干细胞、牛羊膜和羊水干细胞等。如果可以成功分离获得与灵长类更接近动物的羊膜干细胞或者羊水干细胞，对现代兽医学领域或者现代医学领域的细胞来源具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明提供一种黑叶猴羊膜干细胞分离鉴定方法，以解决上述的现有技术的不足。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种黑叶猴羊膜干细胞分离鉴定方法，包括以下步骤：

S1.物理机械分离；

S2.消化分离；

S3.过滤收集；

S4.传代培养。

优选地，所述物理机械分离步骤S1还包括以下步骤：

(1)在4℃无菌环境下，使用镊子将羊膜上皮层从绒毛膜上机械玻璃下来，置于生理盐水中洗涤3-5次，每次10-30s；生理盐水经过高压灭菌且含有0.2mg/ml异帕米星；

(2)在4℃无菌环境下，使用无菌的接种针剔除羊膜层上残留的血管或者脂肪；

(3)使用含有0.1mg/ml异帕米星的生理盐水洗涤3次，在75％的酒精中浸泡2s，然后用PBS反复清洗；

(4)最后将羊膜剪成大约10cm*2小块，置于无菌条件下冷冻保存备用。

优选地，所述消化分离步骤S2还包括以下步骤:

(1)首次消化，在灭菌的500ml三角瓶中，按每10cm2的羊膜中加入10ml 0.2％Trypsin-EDTA或者Tryp LE或者两者的混合液；充分混匀后置于37℃的恒温摇床中进行消化分离；其中1-10min期间，摇床转速为160rpm；11-30min，摇床转速为130rpm；

(2)再次消化，经过首次消化的羊膜转入新的无菌的500ml三角瓶中，按每10cm²的羊膜加入10ml 0.1％Trypsin-EDTA或者Tryp LE或者两者的混合液；充分混匀后置于30℃的恒温摇床中进行消化分离；其中1-15min，摇床转速为110rpm；15-30min，摇床转速为80rpm；