[发明专利]基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法

说明书

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法。该方法包括：a)构建磁性生物复合材料Fe3O4@Au‑S1/S2；b)铅离子依赖性DNA酶的酶切辅助；c)电化学生物传感器的构建：向步骤b)得到的反应物中加入亚甲蓝MB，孵育反应得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号，建立标准曲线；d)样品检测：将凝血酶样品，按上述方法检测，测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中的凝血酶浓度。本发明能够快速、高灵敏高选择性的检测凝血酶，克服了现有检测方法灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，更具体地，涉及一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法。

背景技术

凝血酶是一种丝氨酸蛋白酶，由凝血酶原在Xa因子作用下转化而来，将纤维蛋白原转换为纤维蛋白，在凝血级联机制中有着重要的作用。研究表明，凝血酶与很多疾病如血栓栓塞性疾病、中枢神经性疾病、肾病等有着密切的关系，其浓度的改变会导致功能的转变。例如，在肾组织中，低浓度的凝血酶有细胞保护作用，而高浓度的凝血酶会引起肾脏损伤。因此，定量检测复杂生物样品中的凝血酶含量对临床研究和早期诊断有重要的意义。

目前已经建立了基于适配体的比色法、荧光法、电化学发光法、电化学方法，极大地提高其选择性，其中电化学方法由于具有检测迅速、设备简单便携的优点引起关注。但是这些电化学方法大多需要进行复杂的电极修饰，对实验条件、环境要求严格，技术上限制了广泛应用。因此，需要设计一个简单、准确、灵敏的电化学方法用于凝血酶的检测。

磁性Fe₃O₄@Au纳米材料的磁性特征满足在实验过程简单快速的磁性分离，避免耗时较长的超滤离心操作，而且在测定时通过磁控诱导在电极表面成膜，利用磁性纳米材料吸附固定在磁性玻碳电极表面，而且去除磁芯后可使磁性材料自行脱落，省去了漫长的抛光打磨电极的过程，具有自清洁的特点。另外，它具有较大的比表面积，可以通过表面修饰与DNA材料结合得到生物纳米材料。

DNA分子除了具有基因的遗传特性外，同时也是一个结构精巧的一维纳米线，包括适配体、DNA酶、适配体和DNA酶复合物Aptazyme。由于DNA序列设计灵活、合成方法成熟、价格适宜的优势，成为目前研究的热门材料。其中，适配体特异性识别目标物，提高选择性，拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，稳定性好，可以作为抗体的替代物。金属离子依赖性DNA酶是一段特定的单链DNA序列，在二价金属离子辅助下具有切割底物酶活性，和底链互补后在特定的位点将底链分解成两部分。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法，能够快速、高灵敏高选择性的检测凝血酶，克服了现有检测方法灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。

为了实现上述目的，本发明提供一种基于磁性生物复合材料与铅离子依赖性DNA酶的电化学生物传感器检测凝血酶的方法，包括如下步骤：

a)构建磁性生物复合材料Fe₃O₄@Au-S1/S2：将修饰有引物链S1的磁性Fe₃O₄@Au纳米粒与凝血酶适配体S2共孵育；

b)铅离子依赖性DNA酶的酶切辅助：向步骤a)构建的复合材料中加入不同浓度的凝血酶，在铅离子依赖性DNA酶S3和铅离子的辅助下共孵育；

c)电化学生物传感器的构建：向步骤b)得到的反应物中加入亚甲蓝MB，孵育反应得到样品，将样品通过磁性诱导吸附到磁性玻碳电极表面，测定MB的DPV信号，建立标准曲线；

d)样品检测：将未知浓度的凝血酶样品，按上述方法检测，测得DPV信号，代入标准曲线得到样品中的凝血酶浓度；