[发明专利]一种牛冠状病毒ELISA检测试剂盒有效
| 申请号： | 201810424384.8 | 申请日： | 2018-05-07 |
| 公开（公告）号： | CN108318686B | 公开（公告）日： | 2020-09-04 |
| 发明（设计）人： | 周玉龙;范春玲;倪宏波;朱战波;侯喜林;邵红;武瑞;任亚超;高国强;贾伟强;王梦心;胡林杰;孟野;盛守志;王訢丞;白彪慧;黄晓毅 | 申请（专利权）人： | 黑龙江八一农垦大学 |
| 主分类号： | G01N33/569 | 分类号： | G01N33/569;C07K14/165;C12N15/50;C12N15/70 |
| 代理公司： | 北京君泊知识产权代理有限公司 11496 | 代理人： | 王程远 |
| 地址： | 163319 黑龙江省大庆*** | 国省代码： | 黑龙江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 种牛 冠状病毒 elisa 检测 试剂盒 | ||
1.一种牛冠状病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有重组的N蛋白；所述的重组的N蛋白为BCoV-CD分离株重组pET-32a-N蛋白；
所述的重组的N蛋白是经DNAStar软件预测的N蛋白免疫原性较好的疏水区域；
所述的重组的N蛋白的制备方法，包括步骤A、引物设计与合成:根据GenBank上发布的BCoV-Mebus分离毒株，使用Premier 5.0软件设计N基因引物序列，同时在引物序列上插入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点，便于原核表达；
所述的N基因引物序列如下：
N F：ggatccgatcagtccgaccaatctag，
N R：gtcgacagggctcatccatcttctta。
2.如权利要求1所述的牛冠状病毒ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的重组的N蛋白的制备方法，包括以下步骤：
A、引物设计与合成:根据GenBank上发布的BCoV-Mebus分离毒株，使用Premier 5.0软件设计N基因引物序列，同时在引物序列上插入Sal Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，便于原核表达；
B、重组克隆质粒构建；
C、重组表达载体构建:鉴定正确的阳性BCoV-CD-N-T蛋白基因重组菌进行抽提质粒；将BCoV-CD-N-T质粒与表达载体pET-32a(+)质粒分别用BamH I、Sal I进行双酶切；
D、重组质粒在大肠杆菌BL21中表达；
表达蛋白的提取；重组蛋白SDS-PAGE电泳；染色和脱色；
E、重组蛋白的Western blot鉴定；
F、重组蛋白可溶性分析；
G、重组N蛋白的纯化；
H、重组蛋白浓度测定。
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