[发明专利]生物活性重组人HNP-1蛋白的制备

说明书

本发明涉及一种人HNP‑1蛋白的制备方法，构建并使用大肠杆菌表达体系制备具有生物活性的成熟人HNP‑1蛋白,这是本领域首次利用原核体系表达出具有活性的HNP‑1蛋白。

技术领域

本发明涉及基因工程，具体涉及利用原核表达体系表达有生物活性的人成熟HNP-1蛋白(人α-防御素-1)的方法。

背景技术

防御素是广泛存在于动物、植物及昆虫体内的一类小分子短肽。它能抵御细菌、真菌或病毒等微生物入侵，是生物体免疫系统的组成部分。瑞典科学家Hulmark等1975年从惜古比天蚕(Hyatophora Cecropins)蛹中诱导分离出了第一个杀菌肽Cecropin，开辟了这个新的领域(Hulmark D.Insect immunity:purification and properties of threeinducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae ofHyalophora cecropia.European Journal of Biochemistry,1980,106:7～16)。1980年，美国Robert Lehrer实验室从兔肺巨噬细胞中首先分离得到了一种类似的阳离子性极强的小分子抗菌肽，定名为防御素(Lehrer,R.I.Lu,W.alpha-Defensins in human innateimmunity.Immunological reviews,2012,245:84～112,doi:10.1111/j.1600-065X.2011.01082.x)。

防御素通常由29～54个氨基酸组成，包括6～8个保守半胱氨酸，可通过半胱氨酸分子内二硫键使肽环形成反向平行的β片状或α螺旋结构。根据来源的不同，防御素可分为动物防御素、植物防御素和昆虫防御素；根据分子结构特征，动物防御素又可分为α-防御素、β-防御素和θ-防御素3种。

α-防御素最早从兔肺巨噬细胞中分离得到。这类防御素主要存在于哺乳动物有关组织和细胞中，由29～35个氨基酸组成,富含精氨酸和非常保守的6个半胱氨酸以Cys-l-Cys-6、Cys-2-Cys-4、Cys-3-Cys-5方式形成3对分子内二硫键,其中Cys-l-Cys-6对二硫键连接N端和C端的半胱氨酸形成圆形分子大环。已知兔的中性粒细胞中含有6种α-防御素,即RabNP-1、-2、-3a、-3b、-4、-5,这些防御素总量占细胞蛋白质总量的15％～20％。与兔类似，α-防御素-1(α-defensin-1，HNP-1)是人中性粒细胞的主要防御素分子。这类防御素主要存在于人中性粒细胞的溶酶体颗粒内，是迄今发现含量最多、活性最强的杀菌分子，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及腺病毒、流感病毒、艾滋病毒等均有很强的杀伤活性(Selsted,M.E.Ouellette,A.J.Mammalian defensins in the antimicrobial immuneresponse.Nature immunology,2005,6:551-557,doi:10.1038/ni1206；Lehrer,R.I.Lu,W.alpha-Defensins in human innate immunity.Immunological reviews,2012,245:84-112,doi:10.1111/j.1600-065X.2011.01082.x)。如此广谱的抗性可能是生物长期进化过程中与疾病斗争的结果。其抗微生物的作用机理可以分为抗菌作用、抗病毒的作用、细胞毒作用、免疫调节功能四个方面。