[发明专利]一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法

说明书

本发明公开了一种PhaP‑Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法，在微生物体内融合表达PHA颗粒结合蛋白PhaP和一种抗菌肽Tac(tachyplesin I,简称为Tac)所形成的一种融合蛋白PhaP‑Tac，然后利用PhaP与疏水材料表面间的疏水相互作用，将抗菌肽锚定到疏水材料表面，从而赋予疏水材料抗菌性能。其使用大肠杆菌作为表达宿主表达纯化了细菌来源的PhaP和中华鲎抗菌肽Tac的融合蛋白PhaP‑Tac，赋予PHA材料抗菌活性，经过PhaP‑Tac进行表面修饰的聚3‑羟基丁酸‑3‑羟基戊酸酯(PHBV)可有效的抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长，而且经过修饰的PHBV材料亲水性提高，有利于成纤维细胞附着生长，通过PhaP蛋白将抗菌肽对PHBV材料进行修饰赋予材料抗菌活性，对抑制局部细菌感染是一种行之有效的策略。

技术领域

本发明涉及微生物医药技术领域，具体为一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料PHBV的修饰方法。

背景技术

聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯(PHBV)具有优良的生物相容性，可以作为生物支架等应用于生物医学工程领域。但是，微生物感染限制了这类材料的潜在应用。目前临床上抗生素的使用是预防和治疗生物器械所引起感染的主要方法。但是，由于全球抗生素药物的滥用，引发细菌耐药性、过敏反应和环境污染等问题日渐严重，寻找一种不易引起上述问题的抗菌物质已逐渐成为人们关注的焦点。抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性，不易引起细菌耐药性，并且能够有效抑制临床上一些可导致严重感染的病原体和耐药菌株的抗菌活性物质。使用大肠杆菌作为表达宿主表达纯化了来细菌来源的PHA颗粒结合蛋白PhaP和中华鲎抗菌肽Tac的融合蛋白PhaP-Tac，通过PhaP与PHBV的疏水相互作用将PhaP-Tac结合到PHBV材料表面赋予其抗菌活性。经过PhaP-Tac表面修饰的PHBV可有效的抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的生长。并且经过修饰的PHBV材料亲水性提高，有利于成纤维细胞附着生长，同时，可以加快小鼠伤口的愈合。通过研究结果表明，抗菌肽对PHBV材料进行修饰赋予材料抗菌活性对抑制局部细菌感染是一种行之有效的策略。

发明内容

本发明的目的在于提供一种PhaP-Tac的微生物合成及其对疏水材料的修饰方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种PhaP-Tac的微生物合成，包括：

1)将PhaP蛋白和中华鲎抗菌肽Tac融合形成融合蛋白PhaP-Tac；

2)由融合蛋白PhaP-Tac结合到疏水材料PHBV表面形成抗菌材料PhaP-Tac-PHBV；

3)由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白和中华鲎抗菌肽融合蛋白PhaP-Tac的氨基酸序列如序列表中序列1所示；

所述1)中为确保蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)成功表达，对其密码子进行优化，构建两个质粒pET28aPhaP和pET28aPhaPTac，并将构建质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)分别表达靶蛋白；

PhaP-Tac蛋白以部分可溶形式存在。

一种PhaP-Tac对疏水材料PHBV的修饰方法，由聚羟基脂肪酸酯颗粒结合蛋白和中华鲎素融合蛋白PhaP-Tac的氨基酸序列如序列表中序列1所示；所述方法包括以下步骤：

S1：对融合蛋白PhaP-Tac的纯化；

S2：将融合蛋白PhaP-Tac结合到疏水材料即微生物合成的聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸酯PHBV进行表面修饰，包括将PHBV膜裁剪成直径为15mm的圆片，浸入75％(v/v)的乙醇溶液消毒，然后将PHBV圆片浸泡在含100μg PhaP或PhaP-Tac蛋白溶液的48孔培养皿中，蛋白和膜在4℃孵育12h，最后，用磷酸盐缓冲液清洗膜5min，去除未结合的蛋白；

S3：蛋白免疫印迹分析；