[发明专利]一种钙黄绿素可视化LAMP检测肺炎克雷伯菌的检测反应体系

说明书

本发明公开了一种钙黄绿素可视化LAMP检测肺炎克雷伯菌的检测反应体系，在25μL的反应体积中包括试剂：10×thermosol Buffer，dNTPs，甜菜碱，MgSO₄，内引物对，环引物对，外引物对，钙黄绿素，MnCl₂，Bst聚合酶，DNA模板，RNase‑free water。该检测反应体系具有良好的特异性，且与LAMP琼脂糖凝胶电泳检测方法的敏感性一致，但比PCR方法敏感100倍；在反应前加入钙黄绿素和锰离子，反应产物直接肉眼观察颜色变化即可判断反应结果，无需经过琼脂糖凝胶电泳检测。可以看出，钙黄绿素可视化LAMP方法具有特异性强、灵敏高、操作简单、产物易检测等优点，反应只需要一个恒温水浴锅即可完成检测，适用于基层养殖场对病原菌的快速检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae)是革兰氏阴性，肠杆菌科的一种致病性较强的条件致病菌，呈杆状、无鞭毛、无动力、有较厚的荚膜，由Friediander于1893年从患大叶性肺炎病人的肺组织中首次分离得到。目前，该菌呈世界性分布，主要存在于人与动物的肠道、呼吸道和泌尿生殖道及水、土壤和谷物中，当机体免疫力下降时可引起肺炎、肠炎、脑膜炎、腹膜炎、泌尿系统疾病、创伤感染败血症等多种疾病。近年来，已有多起由该菌引起的人畜感染发病的报道，现已从禽类、两栖类和鱼类等多种动物体内分离到该菌，并呈现增多趋势，给养殖业造成了巨大的损失，并因其在临床上通常表现出多重耐药性使治疗难度大、死亡率高而被广泛重视。因此，建立一种快速检测的方法对肺炎克雷伯菌的感染的预防和控制具有十分重要的意义。

目前常用于肺炎克雷伯菌的检测方法主要是细菌培养鉴定、普通PCR技术和实时荧光PCR技术。细菌培养鉴定操作繁琐，耗时长，且细菌检出阳性率低。而随着核酸检测技术的提高，肺炎克雷伯菌的检测也开始用普通PCR技术和实时荧光PCR技术。普通PCR检测准确度不够、特异性差，而且技术要求高、检测成本高；而实时荧光PCR技术依赖于昂贵的热循环仪器和探针合成，还有熟练的操作人员。因此，以PCR为基础的技术在基层养殖场无法进行，限制了这些技术的广泛运用。

环介导等温扩增技术(LAMP)是2000年由Notomi等人发明的一种新的病原核酸检测技术。该技术针对目标DNA链上的6个区段设计4条不同的引物(FIP，BIP，F3，B3)，在链置换BstDNA聚合酶的作用下于恒温60℃-65℃扩增60min左右，即可进行循环扩增，且效率可达10⁹-10¹⁰个数量级。而钙黄绿素可视化LAMP方法是在反应前的缓冲液中加入锰离子，并用钙黄绿素做荧光指示剂。在LAMP反应之前，钙黄绿素和锰离子结合，反应缓冲液为橘黄色；当有靶基因存在时，发生LAMP反应，产生的焦磷酸根离子剥夺与钙黄绿素结合的锰离子并与之结合，钙黄绿素与剩余的焦磷酸根离子结合产生绿色荧光，从而将LAMP扩增的信号放大，肉眼观察非常明显。该方法具有特异性强、灵敏高、操作简单、产物易检测等优点，反应只需要一个恒温水浴锅即可完成检测，适用于基层养殖场对病原菌的快速检测。

发明内容

本发明提供一种简便快捷，适合养殖基层的现场快速检测的钙黄绿素可视化LAMP检测肺炎克雷伯菌的检测反应体系，其包括：

其中，所述DNA模板是通过构建肺炎克雷伯菌阳性质粒获得。选择肺炎克雷伯菌的FimK基因的保守区域设计特异性引物，将266bp FimK基因序列克隆进pMD19-T载体，构建成肺炎克雷伯菌阳性质粒。测序结果：