[发明专利]一种小球藻保藏方法

说明书

本发明提供一种小球藻保藏方法，属于水产养殖技术领域。该方法将小球藻培养至对数期，向生长至对数期的无杂菌污染的小球藻液中加入体积量百万分之一到万分之一的生物絮凝剂，搅拌5～30分钟，絮凝沉淀2～8小时，将收获小球藻浓缩液放在三角瓶中，加入10％～30％甘油至小球藻浓度为5×10⁷～1×10⁹个/mL，用封口膜封口，放在冰箱内4℃冷藏。本发明具有操作简单、无需专用设备、可以有效避免杂菌污染，保存时间长，活性保持率高等优点，可用于小球藻生产企业小球藻保藏。

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，特别是指一种小球藻保藏方法。

背景技术

世界上没有任何动植物像小球藻那样能够每20h增长4倍，主要是由于小球藻的生长因子决定的。小球藻生长因子(Chlorella Growth Factor，CG F)，也叫小球藻精，是细胞活性物质，包括氨基酸、核酸、多糖、多肽、蛋白质、酶、维生素、矿物质，被称为“类荷尔蒙”。小球藻生长因子具有：激活淋巴细胞、增强人机体免疫能力，活化人体细胞，促进儿童生长发育，抵抗外来疾病入侵，含有许多修复人体器官所需要的核蛋白，可治疗有机物、重金属等中毒；防治胃溃疡、高血压和心血管等疾病。因此，小球藻精在食品、饮品、保健品、医药等领域具有广阔的应用前景。

小球藻单细胞藻种的保藏一直是制约生产培养单位藻种正常供应和长期保存的重要因素。目前，小球藻保藏方法主要有液体保藏法、固体平板保藏法和超低温保藏法等。固体平板保藏法保藏时间往往较短(通常为1-2个月)，操作复杂，由于培养基表面易干燥，需要定期传代，频繁传代不仅增加了人力成本和污染的风险，而且易导致藻种优良性状的退化或丢失。超低温保藏法虽然保藏时间较长，但需要昂贵的设备、耗能大、保存条件苛刻，因此难以得到普遍应用。

发明专利201711100019.3提出了采用琼脂平板保藏小球藻的方法，该方法需要制备土壤浸提液和用到96孔平板，因此不适合于小球藻养殖企业保藏。201010222005.0提出了用安瓿管分装藻种细胞悬液，将微藻程序预冻，然后冷冻保存，对冻干藻粉抽真空保存，此方法可以使微藻保存周期延长，但是操作复杂，保存陈本高，不适合于中小养殖企业保藏菌种。

针对现有微藻藻种保藏方法存在保存时间短、操作繁琐、保藏所需设备贵重等缺陷，本方法提出了一种操作简单、不需要贵重设备、保存效果好、适合于中小企业保藏菌种的方法。

发明内容

本发明现有小球藻保藏技术的不足，提供一种小球藻保藏方法。

该方法包括步骤如下：

(1)将初始pH为6～8的蛋白核小球藻液放在光照培养箱中培养至对数期；

(2)在显微镜下检查确定步骤(1)中培养获得的蛋白核小球藻液无杂菌污染；

(3)量取步骤(2)中培养检查后OD₅₆₀为0.6～1.2的蛋白核小球藻液，按照蛋白核小球藻体积(mL)：生物絮凝剂(g)＝10 000～1 000 000:1的比例加入生物絮凝剂；

(4)调节步骤(3)中所获得的蛋白核小球藻液的pH为6～10；

(5)将步骤(4)所得的蛋白核小球藻液以20～200rpm速度搅拌5～30分钟，然后静置2～8小时，使小球藻絮凝；

(6)取出步骤(5)中小球藻絮凝后的上清液，将蛋白核小球藻浓缩液放在三角瓶中，加入10％～30％的甘油至小球藻浓度为5×10⁷～1×10⁹个/mL，混合均匀后用封口膜密封隔离细菌，放在冰箱内4℃冷藏保存。

其中，步骤(1)中光照培养条件为：温度为25～35℃、照度为3000～5000lx、光照/黑暗为8～16h:8～16h。

步骤(3)中生物絮凝剂为羧甲基壳聚糖、壳聚糖和菌粉中的一种或几种。