[发明专利]干扰IL-6表达的CD19-CAR-T细胞及其应用

说明书

本发明公开了两种干扰人IL‑6基因表达的shRNA，如SEQ ID NO:1、2所示。本发明还公开了一种慢病毒表达载体，其包含有干扰人IL‑6基因表达的shRNA，以及如SEQ ID NO:4所示的编码嵌合抗原受体的核苷酸片段。本发明还公开了一种干扰人IL‑6基因表达的CD19‑CAR‑T细胞，为包含有慢病毒表达载体的T淋巴细胞，或染色体中整合有干扰人IL‑6基因表达的shRNA，以及编码嵌合抗原受体的核苷酸片段的T淋巴细胞。本发明的CAR‑T细胞引入了IL‑6 shRNA，在表达CAR的同时共表达IL‑6的shRNA，通过基因沉默技术从源头抑制IL‑6的释放，从而降低CRS的影响，提高CAR‑T治疗的安全性。可以预计，在制备预防、治疗、辅助治疗恶性肿瘤的药物中将有着重要的应用。

技术领域

本发明涉及干扰IL-6表达的靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(Chimeric AntigenReceptor T cell，CAR-T)的制备及其应用，属于基因工程和细胞生物学领域。

背景技术

1989年，嵌合抗原受体改造T细胞(CAR-T)这一概念被首次提出，目的是建立肿瘤特异性识别能力的过继细胞疗法。第一代CAR的设计是简单的用特异性单克隆抗体来源的scFv(single-chain antibody variable region fragment)段替换TCR(T cellreceptor)的胞外区部分，保留了跨膜结构和胞内传递信号的CD3ζ区域，有的研究组胞内信号传递部分也会采用FcR。但第一代CAR的临床试验结果却非常令人失望，效果最好的一次临床试验也仅仅有2/11个病人有长期的缓解。随着对免疫学认识的不断深入，人们发现CD3ζ信号虽然能够诱导T细胞的活化和短暂增殖，但之后会诱导T细胞的无能(anergy)。1998年，有两个实验室报道了CD28信号结构域可以为CD3ζ信号提供辅助的共刺激功能。因此，第二代CAR的设计在第一代的基础上引入了共刺激分子的部分，如CD28或CD137(4-1BB)的胞内信号结构域。而第三代CAR则是加入了2个共刺激分子的功能信号结构域，包括CD27、CD28、4-1BB、ICOS或OX40(15-18)。现在在临床上进行实验的主要是第二代CAR的设计。

CAR-T的疗效已经被业内所公认，2017年8月30日，美国FDA批准了首个CAR-T药物——Kymriah(tisagenlecleucel)，用于治疗复发或难治性(r/r)儿童和年轻成人B细胞急性淋巴细胞白血病。这是首个获批的免疫细胞药物。一个多月后的10月18日，FDA批准Kite制药Yescarta(axicabtagene ciloleucel，KTE-C10)，用于治疗对其他疗法无响应或者接受过至少2种治疗方案后复发的特定类型成人大B细胞淋巴瘤患者,包括弥漫性大B细胞淋巴瘤、转化型滤泡性淋巴瘤、原发纵隔B细胞淋巴瘤。Yescarta是FDA批准的第2款CAR-T疗法。