[发明专利]用于检测和鉴定生物样品中的核酸序列的组合物和方法

权利要求书

1.用于检测生物样品中的结核分枝杆菌复合群的成员的PCR即用组合物，其包含组分：

以0.1 mM至1 mM的浓度共同存在于所述组合物中的包含基本上等量的dATP、dCTP、dGTP 和dTTP的脱氧核苷酸三磷酸的混合物；

以0.01 mM至1 mM的浓度存在于所述组合物中的选自乙二醇四乙酸、羟乙基乙二胺三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、N,N-双(羧基甲基)甘氨酸、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸盐、柠檬酸钠、柠檬酸钙、柠檬酸铵、柠檬酸氢铵、柠檬酸、柠檬酸二铵、柠檬酸钾、柠檬酸镁、柠檬酸铁铵、柠檬酸锂、和它们的任何组合的螯合剂；

以1 mM至1 M的浓度存在于所述组合物中的PCR摩尔渗透压浓度试剂N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)；

选自牛血清白蛋白、人血清白蛋白、山羊血清白蛋白、哺乳动物白蛋白、和它们的任何组合的白蛋白；

以50 mM至1 M的浓度共同存在于所述组合物中的至少两种盐，第一种是选自氯化钾和谷氨酸钾的钾盐，且第二种是选自氯化镁和硫酸镁的镁盐；和

以1 mM至1 M的浓度存在于所述组合物中的选自三(羟基甲基)氨基甲烷(Tris)、柠檬酸盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、1,3-双(三(羟基甲基)甲基氨基)丙烷(Bis-Tris)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-[三(羟基甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N-2-乙酰胺基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、碳酸氢盐、磷酸盐和它们的任何组合的缓冲剂，pH为6.5至9.0，其中所述缓冲剂的pKa 在环境温度下的所述组合物的pH 的一个单位之内，其中所述组分与不含核酸酶的水相组合；且其中所述组合物包含一种或多种染料；

以0.05U至1 U的量存在的热稳定聚合酶；

与对结核分枝杆菌复合群的成员特异性的PCR扩增的核酸序列结合的标记的检测探针，其中所述标记的检测探针是20个至35个核苷酸长度的分枝杆菌特异性序列，并且包含SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 7的序列；以及

配置成通过PCR扩增对结核分枝杆菌复合群的成员特异性的核酸序列的PCR引物对，所述PCR引物对以0.5 µM至50 µM的浓度共同存在于组合物中，其中各PCR引物为18个至35个核苷酸长度。

2.权利要求1中所请求保护的组合物，其中所述组合物在融化和再冷冻10次后维持PCR扩增活性。

3.权利要求1或2中所请求保护的组合物，其中所述白蛋白以5 ng/ml至100 ng/ml的浓度存在于所述组合物中。

4.权利要求1或2中所请求保护的组合物，其中所述一种或多种染料选自荧光素、ROX^TM和5-羧基-X-罗丹明。

5.权利要求1或2中任一项所请求保护的组合物，其中所述pH是6.5至7.5；和/或所述缓冲剂的pKa是所述缓冲剂在环境温度的pH的0.5之内；优选是所述缓冲剂在环境温度的pH的0.2之内。

6.任何前述权利要求中所请求保护的组合物，进一步包含以1 fg至1 ng的浓度存在于所述组合物中的对照核酸，所述对照核酸提供了PCR扩增的定性或定量量度。

7.权利要求6中所请求保护的组合物，其中所述对照核酸包含SEQ ID NO 8的序列，SEQID NO 12的序列或SEQ ID NO 21的序列。