[发明专利]鱼胶原抗氧化肽的制备方法

权利要求书

1.鱼胶原抗氧化肽的制备方法，包括原料预处理、胶原蛋白粉制备、酶解、纳滤、凝胶柱层析和RP-HPLC纯化，其特征在于：所述RP-HPLC纯化步骤为：将凝胶柱层析酶解物用双蒸水配成溶液，利用高效液相色谱进行分离，流动相为乙腈和酒石酸水溶液，将属于同一峰的收集液混合，除去乙腈和酒石酸，冻干，即得鱼胶原抗氧化肽。

2.根据权利要求1所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述酒石酸水溶液浓度为0.08-0.12%，所述乙腈和酒石酸水溶液的体积比为20-70:1。

3.根据权利要求1所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述酒石酸中L-酒石酸和D-酒石酸的比例为86-93:1。

4.根据权利要求1所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述色谱条件为：溶液的浓度为80-100μg/mL、进样量为4-6μL、色谱柱为Agilent C₁₈（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、洗脱速度为0.8-1.2mL/min。

5.根据权利要求1所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述原料预处理步骤为：将鱼皮切碎后组织捣碎，按料液比为1:4-6g/mL将鱼皮加入浓度为0.08-0.13M的氧氧化钠溶液中，浸泡并不断搅动，1.5-2.5h后用流动水冲洗至中性，再按料液比为1:1.5-2.5g/mL加入浓度为2-5%的异丙醇溶液，浸泡10-15h后用蒸馏水反复清洗至中性后过滤，沥干，即得预处理鱼皮。

6.根据权利要求1所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述胶原蛋白粉制备步骤为：按料液比为1:8-11向预处理鱼皮中加入浓度为0.2-0.5M乙酸溶液，搅拌浸提5-7h，离心取上清，沉淀继续进行二次酸提取，离心上清液减压蒸馏，冷冻干燥即得胶原蛋白粉。

7.根据权利要求1所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述酶解步骤为：按底物浓度为8-10%向胶原蛋白粉中加入去离子水，调节pH至7.4-8.6，按加酶量为2.4-3.5%和1.6-2.0%分别加入胶原酶和风味蛋白酶，然后在温度为30-40℃下酶解10-15h，酶解间隔1-2h用截留分子量为8-12kDa的超滤膜超滤10-20min，即得超滤液。

8.根据权利要求7所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述去离子水含有0.2-0.4M氯化钾和3-5mM羧甲基纤维素钠。

9.根据权利要求1所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述纳滤步骤为：将超滤液经1-1.2kDa的纳滤膜纳滤，获得1-1.2kDa以上的浓缩多肽液，备用。

10.根据权利要求1所述的鱼胶原抗氧化肽的制备方法，其特征在于：所述凝胶柱层析步骤为：将浓缩多肽液溶于双蒸水配成浓度为45-55mg/mL的溶液，离心上清液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，具有最高自由基清除活性的峰为凝胶柱层析酶解物。