[发明专利]隐孢子虫多表位基因片段cpmcef及其融合蛋白和应用

说明书

本发明公开了一种隐孢子虫多表位融合蛋白，包含：SEQ ID NO.1～10所示表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。本发明还公开了隐孢子虫多表位基因片段，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。本发明隐孢子虫多表位基因片段，经原核表达后所得的重组蛋白，或克隆至真核载体所得的真核重组载体，无论是单独免疫，还是添加大蒜素，对小鼠泰泽隐孢子虫感染都有很好的保护作用，适于作为抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种隐孢子虫多表位基因片段cpmcef及其融合蛋白和应用。

背景技术

隐孢子虫病(cryptosporidiosis)是由隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)引起的人兽共患传染病，在健康的人和动物中，常引起自限性腹泻；而在免疫功能缺陷的患者，如艾滋病(AIDS)病人、器官移植病人中，可导致严重疾病，甚至威胁生命。调查显示，隐孢子虫是继轮状病毒后，引起全球五岁以下儿童腹泻第二重要的病原，而全世界10.5％儿童死亡是由腹泻引起的。目前该病尚无特效治疗药物，绝大多数抗生素、抗寄生虫药均无效；亦缺乏获得临床批文的预防疫苗，现有抗原制备的疫苗的免疫保护效果均不够理想。因此，寻找和研制新型的隐孢子虫抗原、研制高效的隐孢子虫病预防疫苗十分迫切。

在以往的隐孢子虫疫苗研究中，人们通常使用单一的隐孢子虫抗原基因，构建核酸疫苗或活载体疫苗；或使用其表达的融合蛋白，制备亚单位疫苗。但是，此类疫苗的保护效果均不够令人满意。其原因可能是由于隐孢子虫基因组巨大，生活史复杂，抗原种类繁多，达数千种之多，单一的抗原无法彻底阻断病原在宿主体内的生活周期。另一方面，使用多抗原疫苗时，由于载体容量有限，并且大分子蛋白可能会造成动物免疫病理反应，所以在单一载体中加入多个抗原存在很大的局限性。近年来，国际上兴起了利用抗原表位预测工具、开展抗原表位预测、构建多表位疫苗(multi-epitope vaccine)的热潮，取得了阶段性成果，尤其在抗疟疾多表位疫苗研制领域，已设计合成了多个基因工程疫苗和合成肽疫苗，取得了较好的免疫保护效果。目前国内外尚缺乏隐孢子虫多表位疫苗的研究报道。

发明内容

本发明要解决目前缺少高效的隐孢子虫疫苗的技术问题，提供一种隐孢子虫多表位基因片段cpmcef，利用该基因片段制备的融合蛋白、及构建的真核重组质粒，可用于制备抗隐孢子虫病的多表位疫苗。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种隐孢子虫多表位融合蛋白，包含：SEQ ID NO.1～10所示表位序列以任意顺序相互串联形成的氨基酸序列。

优选的，各表位序列之间设有柔性氨基酸组成的接头序列。在各个表位序列之间加入柔性氨基酸组成的接头序列，能使各个抗原表位在空间上互相独立，防止各表位多肽分子由于空间结构发生变化而阻碍其和MHC(Major Histocompatibility Complex,主要组织相容性复合体，具有抗原呈递作用)分子的结合；同时在各个表位之间用接头序列连接，可适当提高免疫肽分子量，以增强多表位融合蛋白的免疫原性。

更优选的，所述融合蛋白具有SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种隐孢子虫多表位基因片段，其包含编码上述融合蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述隐孢子虫多表位基因片段包含编码SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的核苷酸序列。更优选的，所述隐孢子虫多表位基因片段具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述隐孢子虫多表位基因片段的真核重组载体。

优选的，所述真核重组载体还包含细胞因子序列、和/或CpG序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种疫苗，包含上述隐孢子虫多表位融合蛋白、或真核重组载体。