[发明专利]大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种大片段区域基因组的捕获探针的制备方法，其包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将混合物破碎成规定片段；在规定片段的两端接上含有RNA聚合酶识别序列的接头，构建成文库；使用RNA聚合酶将所得到的文库中的片段转录成RNA产物；加入DNA消化酶，将RNA产物中的DNA链消化；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。在本发明中，采用将待捕获区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现了更高的灵敏度。

技术领域

本发明涉及生物样品的制备和处理，更具体而言，涉及一种大片段基因组的捕获探针的制备方法及试剂盒。

背景技术

高通量测序技术自2005年诞生以来，展示了广阔的应用前景。通过测序科学家可以看到单核苷酸多态性、突变热点、基因组结构变异、群体多态性等重要信息。而在很多研究中，并不需要对全基因组进行测序，全基因组测序数据要求大，并非适合所有应用领域。因此在生化方法领域，产生了很多靶区域测序的捕获方法，这其中主要以探针捕获和多重PCR两种方法为主。探针捕获适合制作长而大的基因组区域，而多重PCR适合制作小区域。

在探针捕获领域，已经开发了有很多制备探针的方法。典型地，以罗氏公司的芯片捕获DNA探针合成以及安捷伦公司的RNA探针合成为主。DNA探针的刚性强，探针对应区域如果有大片段的插入或缺失则较难捕获下来。虽然短片段DNA探针的化学合成成本很低，但随着片段长度的增加，化学合成方法的成本会显著增加。安捷伦开创的RNA杂交捕获探针是长度统一的120mer的单一靶标特异性RNA探针，但定制性捕获价格较高。

专利文献1(公开号为105506035A)公开了一种RNA探针制备的方法。具体而言，在专利文献1中，该方法以所述多重DNA片段为模板，加入RNA聚合酶和带有生物素或荧光标记的biotin-dUTP进行反应，将UTP参入产物，纯化后得到RNA探针。最终得到的RNA探针是100-500mer长度的RNA探针。然而，这些RNA探针中部分探针长度过长，在过量的环境下容易自我退火形成二级结构，使得探针在使用时结合效率降低。然而，在上述专利文献中，需要扩增产物构建载体，然后再用构建的克隆载体为对象，进行基因探针制备，不适合大量区域的捕获。

此外，也有一些文献公开了其他基因探针制备的方法，包括如下几种：(1)在PCR后直接加接头，也是小区域片段，且并没有将转录后残留的DNA去除；(2)需要合成DNA探针，因此合成成本会较高，而且制备单链时需要单向扩增，这种扩增方法属于线性扩增，效率通常较差；(3)制备单链需要经过多次试验后外切酶水解，步骤较多，会产生一定的偏差，同时酶效率也会影响探针的制备质量。

发明内容

本发明是鉴于上述现有的状况而完成的，其目的在于提供一种能够在使用探针时改善结合效率的大片段区域基因组捕获探针的制备方法。

为此，本发明的一方面提供了一种大片段区域基因组捕获探针的制备方法，其包括：设计PCR引物对待捕获基因组进行PCR反应扩增；将在PCR反应中所产生的PCR产物混合成混合物，并将所述混合物破碎成规定片段；在所述规定片段的两端接上含有RNA聚合酶识别序列的接头，构建成文库；使用RNA聚合酶将所得到的所述文库中的片段转录成RNA产物；加入DNA消化酶，将所述RNA产物中的DNA链消化；并且消化后的产物经纯化处理，得到捕获的基因探针。

在本发明的一方面中，采用将待捕获大片段区域基因的扩增产物破碎成规定片段，经过后续反应得到适合长度的基因探针(RNA探针)。这个长度范围的RNA不易自我退火形成二级结构，使用探针时结合效率较高。由此，能够在确保特异性的同时具有更好的容错性，实现了更高的灵敏度。