[发明专利]一种植物遗传转化筛选载体及其应用

说明书

本发明提供了一种植物遗传转化筛选载体及其应用，该载体利用包含水稻P450基因(CYP81A6)的表达盒作为筛选标记，以苯达松或苄嘧磺隆作为筛选剂在愈伤组织阶段进行筛选，所获得植株经检测为转基因阳性植株并具备对除草剂高抗性。本发明的植物遗传转化载体可作为转基因筛选载体附加其他功能元件使用，在转基因过程中利用水稻自身基因，不引入菌源等外源筛选标记基因，不仅丰富了植物转基因筛选方法，还可降低公众对转基因植物安全风险的担忧，有利于促进转基因植物的商业化应用，具备良好的市场价值和社会效益。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种植物遗传转化筛选载体及其应用。

背景技术

转基因技术由于其诸多的优点如可拓宽可利用的基因资源，创造新种质资源；可对植物性状进行定向定点变异和选择；为培育高产、优质、高抗优良品种提供新途径等，其应用范围越来越广泛。转基因作物自1996年批准商业化种植起，21年间，全球累计批准23种转基因作物进行商业化生产，涉及包括抗虫、抗除草剂、抗病、育性改变、品质改良等在内的超过16类目标性状。据统计，2016年全球26个国家和地区种植以抗除草剂和抗虫为主的大豆、玉米、棉花、油菜等转基因作物，面积达1.85亿公顷。转基因作物的大面积推广，为全球农业生产做出了巨大贡献。

尽管人们对转基因产品的态度日趋客观和积极，但转基因产品自诞生之日起产生的争议，至今甚嚣尘上，其潜在安全风险问题仍受到普遍关切，因此，转基因产品仍需要加以严格的控制和监管。在转基因作物中争议关键之一是筛选标记可能带来的潜在风险，其转入植物后其对靶标生物抗性，所表达蛋白质致敏性，及对受体作物本身营养成分、天然毒素和抗营养物质含量等方面的影响是未知的。目前使用最多的是抗生素类和除草剂类筛选标记，如潮霉素-HPT筛选系统、卡纳霉素-NPTII筛选系统、草丁膦-Bar筛选系统等，绝大多数为细菌等来源的外源基因，这也是引起公众担忧的原因之一。如果能用植物内源的基因作为筛选标记重新转化植物可去除外源基因引起的风险和担忧。

苯达松(bentazon)是一种苯并噻二唑类除草剂，属杂环类选择性化学除草剂，多数阔叶类杂草和莎草科杂草对苯达松敏感，而包括水稻在内的禾本科和豆科植物则有较强的耐药性，其具有广谱，高效，低毒的特性。水稻对苯达松抗性由一个单隐性基因细胞色素P450(CYP81A6)控制，该基因位于水稻第3号染色体上，参与苯达松在植物体内的羟基化脱毒过程(Pan G,Zhang X,Liu K,Zhang J,Wu X,Zhu J,Tu J(2006)Map-based cloning ofa novel rice cytochrome P450gene CYP81A6that confers resistance to twodifferent classes of herbicides.Plant molecular biology 61:933-943)。

苄嘧磺隆又名农得时，是一种磺酰脲类除草剂，为选择性内吸传导型除草剂，可防除阔叶杂草和莎草科杂草。但对水稻生长几乎没有影响。水稻对苄嘧磺隆抗性与对苯达松抗性均源于水稻中的细胞色素P450(CYP81A6)基因(张集文(2010)水稻苯达松敏感突变研究进展.中国水稻科学24(5):551-558)。

发明内容

本发明的目的是为解决目前基因转化工作中所使用外源筛选标记存在安全风险的问题，提供一种利用植物内源基因作为筛选标记从而应用于植物遗传转化筛选的载体。

为达到上述目的，本发明首先提供一种植物转基因筛选表达盒，以植物内源基因作为筛选标记。

所述表达盒还包括位于上游的植物组成型启动子或植物组织特异性启动子，以及位于下游的终止子，

其中所述植物组成型启动子为水稻或玉米的Ubi启动子、CAMV35S启动子或Actin启动子；所述植物组织特异性启动子为Rubisco小亚基启动子或Cab启动子。

所述终止子包括：NOS终止子，Ubi终止子等在植物中可以终止基因转录的DNA序列。优选的，所述终止子为Ubi终止子。