[发明专利]细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体

说明书

本发明涉及一种细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体，包括步骤：采用pReceiver‑M98质粒，构建出用EGFP标记LRP4的完整开放阅读框架的真核表达载体，得到重组质粒；将重组质粒转染培养好的HEK293T细胞，得到携带重组质粒的HEK293T细胞；将携带重组质粒的表达细胞依次进行培养、细胞固定、封闭和孵育，然后采用荧光显微镜进行观察，检测出低密度脂蛋白受体相关蛋白。本发明提供的采用细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体，因抗原抗体一一对应，特异性几乎达到100％，为重症肌无力患者的诊治提供了必要的实验依据，对重症肌无力患者的诊治提供了新的方向，具有重要的意义。

技术领域

本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体。

背景技术

自1672年重症肌无力(MG)被发现以来，其发病机制通常被认为主要与乙酰胆碱受体抗体(AChR-Ab)介导的体液免疫息息相关，但是随着众多科学家对MG免疫学发病机制的深入研究，现在普遍认为多种肌肉抗原(例如：MuSK-Ab)、补体系统、抗原特异性T淋巴细胞、细胞因子以及胸腺等均对MG的发病起到了重要作用。

对MG患者进行血清学抗体检测及其免疫学致病机制的研究已经逐渐成为世界范围内该病讨论的热点问题，约有85％的MG患者血清中可检测出AChR-Ab；余下的MG患者约有70％血清中可以检测出肌肉特异性酪氨酸激酶抗体(MuSK-Ab)。实验证实，在贵州高海拔多民族聚集地区所收集的共计116例MG患者中，AChR-Ab单阳性率为50.0％。其中女性占大多数；分型以眼肌型及轻度全身型为主。56名未检测出AChR-Ab抗体的MG患者中仅有6人(10.7％)检测出MuSK-Ab阳性。这个比例远低于欧美人种的数据，但与国内相关资料接近。

虽然大部分的MG患者可检测出AChR-Ab和MuSK-Ab，但仍然有一部分病人(10％左右)体内无法检测出上述两种抗体，他们体内是否存在未知的致病性抗体尚不明确，这种类型重症肌无力患者的出现给临床诊治带来了一定的困难。2011年，Higuchi等首次在dSN-MG患者血清中检测出了LRP4-Ab，故认为新发现的LRP4是dSN-MG患者体内自身抗体的靶目标。这些抗体属于IgG1，它可能通过抑制神经元释放的Agrin与胞外LRP4的结合、介导NMJ传递障碍而致病。同时，LRP4-Ab激活补体系统导致体内发生自身抗原抗体免疫反应，Agrin-LRP4-MuSK信号通路受到破坏而致病。Higuchi的实验检测发现300例dSN-MG患者中共有9例LRP4-Ab阳性(3％)。Pevzner等共检测13例dSN-MG，7例LRP4-Ab呈明显阳性(阳性率约为53.8％)；Tzartos的研究表明，约有9.2％的dSN-MG患者血清中检测出LRP4-Ab；Georgios等检测并分析了3例同人种的LRP4-Ab阳性患者的人口学特点、临床表现及疗效。这些发现均表明LRP4-Ab可能是dSN-MG患者新的诊断标志物。故中国人中该抗体的阳性率为多少，以及检测方法是我们研究的目标。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种细胞分析法检测低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体，以提高检测方法的特异性，为重症肌无力患者的诊治提供了必要的实验依据，对重症肌无力患者的诊治提供了新的方向，具有重要的意义。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种检测低密度脂蛋白受体相关蛋白的方法，包括步骤：构建重组质粒；将重组质粒转染培养好的HEK293T细胞，得到携带重组质粒的HEK293T细胞；将携带重组质粒的表达细胞(HEK293T细胞)依次进行培养、细胞固定、封闭和孵育，然后采用荧光显微镜进行观察，检测出低密度脂蛋白受体相关蛋白。