[发明专利]一种动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法

说明书

本发明公开了一种动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法，采用如下步骤：粪样采集、滤除粪渣、一次沉淀、虫卵漂浮、二次沉淀、三次沉淀、虫卵孵化、幼虫收集。本发明提供一种高效的动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法。它避免了霉菌污染整个孵化过程，减少了木炭末和蔗糖等的去除程序和杂质困扰，简化了操作步骤，粪渣去除率高，缩短了孵化时间，可直接监测孵化过程，避免了检测回收和样本浪费，24孔单独孵化可提供科学试验方便，适于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法。

背景技术

胃肠道线虫病是一种常见的人兽共患寄生虫病。线虫感染有其特定的生活史，一般为成虫寄生在感染宿主的胃肠道内，产生大量的卵随粪便排出体外，卵在适宜条件下发育成感染性虫卵或幼虫，经口进入消化道从而感染宿主。在胃肠道线虫的相关科学研究时，需要孵化并收集大量的各期幼虫。然而，目前尚没有高效快捷的动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法，胃肠道线虫幼虫的获得主要是采用平皿孵化法，再应用土壤及植物根结线虫的收集方法如贝尔曼漏斗法或蔗糖浮选法等。平皿孵化法对动物胃肠道线虫的孵化效率较低，容易滋生霉菌，粪渣和木炭末很难去除；贝尔曼漏斗法并不能使线虫与粪便中的其它嗜水蠕虫进行分离；蔗糖浮选法收集的幼虫量较低，且很难除糖。针对这些缺点，很难实现大量幼虫的获得。因此，急需一种高效的动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法。

发明内容

本发明旨在解决胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法缺乏问题，克服幼虫孵化率低、无法去除杂质、混合感染蠕虫分离、后期除糖、收集困难等，并提供一种高效的动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法。

本发明的技术方案如下：

一种动物胃肠道线虫幼虫孵化与收集方法，采用如下步骤：

1、粪样采集：选取4个月以上未驱虫的目标动物，通过直肠无菌采集新鲜粪便，装入无菌样本袋内；将采集到的粪便于2-8 ℃运输并保存，72 h内进行粪便虫卵收集处理；

2、滤除粪渣：称取20 g粪便样本放入洁净三角瓶中，用玻璃棒将粪便捣碎，加入10倍重量的灭菌蒸馏水，放入玻璃珠，反复旋摇三角瓶，使粪便充分破碎并释放虫卵；用40目筛滤除粪渣，再用灭菌蒸馏水将虫卵从粪渣充分洗入滤液中，收集滤液；

3、一次沉淀：将收集的滤液分装于50 ml离心管中，1500 r/min 离心4 min或静置20h，使虫卵沉淀到离心管底部，弃上清；

4、虫卵漂浮：在沉淀中加入饱和食盐水至50ml刻度，漩涡震荡15 s，静置10 min，1000r/min 离心4 min，静置5 min，立即用1000 μl移液器，与液面呈45°角，枪头口一半露出于液面上，带气吸取液面表层漂浮物；每50 ml吸取5 ml，分别转移入各个新离心管内；

5、二次沉淀：于各个新离心管中加入40 ml灭菌蒸馏水，1000 r/min 离心4 min，使大部分虫卵沉淀到离心管底部，用移液器从上至下慢慢地吸取25 ml上层液体弃掉，吸取时使枪头刚刚浸入液面下即可；

6、三次沉淀：加入25 ml灭菌蒸馏水，1500 r/min 离心4 min，使虫卵沉淀到离心管底部，弃上清；

7、虫卵孵化：按照体积比灭菌蒸馏水和Earle’s液1:1的比例配制平衡液，根据实际需要调整虫卵浓度，于各个新离心管中加入5-10 ml平衡液，混匀并分装于24孔板内，于28-32℃，相对湿度70-80%下孵化；

8、幼虫收集：恒温安静孵化48 h后，在倒置显微镜下观察虫卵孵化情况，每隔12 h观察一次，孵化出的大多数幼虫沉淀在24孔板底部，根据需要，能直接收集各期幼虫。

本发明的优点在于：