[发明专利]浅水湖泊越冬蓝藻种源清除窗口期的确定方法

权利要求书

1.一种浅水湖泊越冬蓝藻种源清除窗口期的确定方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）在湖泊布设采样点，获取采样点处表层底泥样品；

（2）从表层底泥样品中提取RNA，采用相对定量实时荧光定量PCR方法测定藻蓝蛋白合成基因PC-IGS、藻毒素合成基因mcyA和伪空胞合成基因gvpC的相对表达量；

（3）以时间为横坐标，基因相对表达量的值为纵坐标绘制曲线，根据三个基因的相对表达量随时间变化的曲线，综合分析确定越冬蓝藻种源清除的窗口期。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，在采样点处每月采集一次表层底泥样品；将采集的底泥样品迅速混合均匀，加入RNAlater保护液，保护液和底泥样品混合均匀后在室温下保温5min，后放入液氮中保存，带回室内-70℃保存直到RNA提取。

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，根据湖泊面积大小和湖泊形态，在全湖范围内布设采样点，所全湖范围内采样点布置方式为：湖泊面积在5-50 km²之间，全湖布置3-10个采样点；湖泊面积在50-500 km²之间，全湖布置10-15个采样点；湖泊面积在500-2000 km²之间，全湖布置16-25个采样点；湖泊面积在2000-3000 km²之间，全湖布置25-35个采样点；此外，在封闭湖湾区增加采样点。

4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，底泥中RNA采用FastRNAPro Soil Direct Kit试剂盒提取，采用Transciptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录，之后采用相对定量实时荧光定量PCR方法测定藻蓝蛋白合成基因PC-IGS、藻毒素合成基因mcyA和伪空胞合成基因gvpC的相对表达量。

5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，qRT-RCR反应体系为25 μL，其中含12.5 μL 2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2 μM引物，1 μL模板，无RNA酶的水10.5 μL；扩增程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15 s，60 ℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环。

6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，针对各个目的基因所设计引物如下：

PC-IGS基因

188F5’-GCTACTTCGACCGCGCC-3’；

254R 5’-TCCTACGGTTTAATTGAGACTAGCC-3’；

mcyA基因

mcyA-F 5’-AAAATTAAAAGCCGTATCAAA-3’；

mcyA-R 5’-AAAAGTGTTTTATTAGCGGCTCAT-3’）；

gvpC基因

gvpC-F 5’-TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3’；

gvpC-R 5’-TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3’）。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，当基因相对表达量的值同时满足PC-IGS相对表达量>3、mcyA相对表达量>0.03且gvpC相对表达量>0.004时，判定蓝藻进入复苏期，以满足前述条件的最早的日期减去15天为蓝藻复苏窗口期。

8.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，还包括，根据湖泊不同采样点的三种基因相对表达量高低进行排序，通过空间网格划分和空间插值，对湖泊进行分区，同时满足PC-IGS相对表达量>3、mcyA相对表达量>0.03和gvpC相对表达量>0.004的区域确定为越冬蓝藻的复苏区域。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用GIS布设网格，利用Arcgis软件的法进行空间插值和数据储存，空间插值采用反距离权重插值法。