[发明专利]一种用于肠道中双歧杆菌属定量的引物及定量方法

权利要求书

1.一种构建用于定量肠道中双歧杆菌属引物的方法，包括以下步骤：

1）引物设计：

比对已经完成全基因组测序的所有双歧杆菌基因序列，寻找其共有核心基因，筛选出单拷贝核心基因，以单拷贝核心基因为目的序列设计引物；

2）引物初步筛选：

以4株双歧杆菌模式菌株为扩增模板进行PCR，利用琼脂糖凝胶电泳初步评估引物的扩增效果并确定最佳退火温度；

3）特异性试验再次筛选引物；

所述共有核心基因rp1N的序列为TCGTCCACTGAGCAAGACCAAGCGTTGGCGTCTCGATTCCATTATCGAGCGCGCTAAGTAACAAGTTCGGCAAGGCTCGCCAATCACCCGGCCCGCCCCATAGGAGCGGGCCGGGTGATTGGGGAGAACCAGCTCGGCTAAGGAGAATCAATGATTCAGCAGGAAACGCGGCTTCATGTCGCCGACAACACGGGTGCGAAGGAACTCCTCGCCATCCGAGTGCTCGGCGGATCGAAGCGACGCTATGCCGGCATCGGCGACGTGATCGTCGCCTCCGTCAAGGACGCAATCCCTGGCGGGTCGGTCAAGAAGGGCGACGTGGTCAAGGCCGTCGTCGTCCGTACAGTCAAGGAACGCCGCCGTGCAGACGGCTCCTACATCAAGTTCGACGAGAACGCCGCTGTGATTCTCGGCTCCGGCCGTGAACCCAAGGGCACTCGTATCTTCGGACCGGTTGGTCGTGAACTGCGCGACAAGCGCTTCATGCGTATCGTGTCCCTCGCACCGGAGGTGATCTGACATGGTAGCCAAGATCAAGAGCGGCGACCTCGTCAAGGTCATTCGTGGCAAGGACCGCGGCAAGGAAGGCACCGTCAAGCGCGTTCTCAAGGACGACCGACTGATCGTCGAAGGCGTTCAGATCGTCAAGAAGCATGTGCGTGCAACCCA；

所述引物的上游序列为ATCAATGATTCAGCAGGAAACGC，下游序列为GTTCTCGTCGAACTTGATGTAGG；

所述引物的PCR扩增片段大小为250bp；

所述双歧杆菌模式菌株为Bifidobacterium animalis subsp.animalis，保藏编号ATCC 25527^T、Bifidobacterium bifidum，保藏编号DSM20456、Bifidobacterium gallicum，保藏编号DSM 20093和Bifidobacteriumlongum subsp.infantis，保藏编号DSM20088。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述引物的PCR扩增最佳退火温度为60℃。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤3）中特异性试验为依次使用琼脂糖凝胶电泳筛选、和微滴式数字PCR评估所述引物。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳使用模式菌株为扩增模板进行PCR；所述微滴式数字PCR为借助QX200 Droplet Digital PCR系统依次对（a）双歧杆菌属亲缘相近的7个属乳酸杆菌属、链球菌属、乳球菌属、片球菌属、肠球菌属、肠膜明串珠菌属、魏斯氏菌属的其中一株模式菌株DNA稀释液、（b）不同浓度的Bifidobacterium bifidum DSM20456模式菌株DNA稀释液、（c）灭菌超纯水和（d）一份粪便DNA稀释液进行定量检测。

5.一种利用权利要求1所述的构建方法得到的引物在制备定量肠道中双歧杆菌属的试剂盒中的应用，包括提取待检粪便DNA、将待检粪便DNA稀释液与权利要求1所述构建方法得到的上下游引物进行微滴式数字PCR、并将PCR扩增片段使用微滴分析仪进行检测和分析。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述微滴式数字PCR的ddPCR反应液为2ul待检DNA、权利要求1所述构建方法得到的上下游引物各0.2ul、10ul 2×ddPCR SuperMix和7.6ul的灭菌超纯水混合；所述微滴式数字PCR的扩增条件为95℃10min；95℃ 30s，60℃40s，40个循环；4℃，5min，90℃，5min。