[发明专利]一种用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物对及测序方法

说明书

本发明提供了一种用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物对，包括上游引物Bif‑11F与下游引物Bif‑11R，以其为扩增引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，SMRT高通量测序之后，以所有已知双歧杆菌的序列使用QIIME(V1.7)平台对扩增序列进行物种注释，得到准确的鉴定结果。本发明提供的用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物是基于双歧杆菌共有核心基因序列设计的，可以在种水平扩增出双歧杆菌，具有较好的特异性和实用性，能较好反映肠道中双歧杆菌的多样性。同时适用于发酵乳制品、粪便和土壤等样品中双歧杆菌的分析。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物及定量方法。

背景技术

双歧杆菌是存在于人和动物的胃肠道中的一种革兰氏阳性厌氧菌。它最早分离自母乳喂养婴儿的粪便，目前包含69个确定种。通常被认为具有促进健康的作用，因此被广泛应用于食品和益生产品中。而且在上世纪初就认为双歧杆菌是人与微生物相互作用中的关键共生体，并认为其在维持健康的胃肠道中起着关键的作用。随着生物技术的发展，越来越多的、不可培养的微生物被发现。双歧杆菌作为肠道中常见细菌之一，通常认为其具有的益生作用，可作为评估健康的关键指标之一。但是具体哪些双歧杆菌在肠道中起作用，它们的存在与肠道中其他的细菌有什么联系，这些目前还无法实现。

目前用于肠道中细菌多样性分析的细菌通用引物可以同时扩增出其中的大部分细菌，尤其是其中的优势菌群，但是无法在种水平扩增出相对含量较低的双歧杆菌，特别是缺少能够实现对肠道中双歧杆菌属绝大多数或全部种双歧杆菌进行高通量测序的扩增引物对。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物对，所述引物对的上游序列为SEQ ID NO.1所示的Bif-11F和SEQ ID NO.2所示的Bif-11R：

Bif-11F：5’-AAGAAGAAGGCCACCAAGTAYT-3’，其中，Y为简并碱基，表示C或T；

Bif-11R：5’-GGTAAGAGTCGGACGCTGTGCAATAA-3’。

优选地，本发明所述的用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物对中，所述引物对的PCR扩增片段大小约625bp。

优选地，本发明所述的用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物对中，所述引物对的PCR扩增最佳退火温度为60℃。

本发明的另一目的在于提供上述用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物对鉴定双歧杆菌属的方法，包括如下步骤：

S1：提取含有双歧杆菌的待测样品的基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，以所述Bif-11F和Bif-11R为扩增引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

S2：序列测定及比对：将PCR扩增产物纯化后，获得PCR扩增片段，对所述PCR扩增片段进行SMRT高通量测序；

S3：以所有已知双歧杆菌的序列作为比对数据库，使用QIIME(V1.7)平台对扩增序列进行物种注释，得到准确的鉴定结果。

优选地，本发明所述的用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物对鉴定双歧杆菌属的方法中，所述步骤S1中PCR扩增体系为：以50ul的总体系计，所述扩增体系包括1ul的20ng/ul DNA模板，2×KAPA HiFi HotStartReady Mix25ul，10μM的Bif-11F和Bif-11R各1.2ul，余量为蒸馏水或灭菌去离子水。

优选地，本发明所述的用于肠道中双歧杆菌属测序的扩增引物对鉴定双歧杆菌属的方法中，所述步骤S1中的PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min循环1次，95℃变性1min循环30次，60℃退火1min，72℃延伸2min，72℃最终延伸7min循环1次。