[发明专利]一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法

说明书

本发明涉及一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，通过LPS体外处理RAW264.7细胞，LPS浓度为1‑1000ng/ml，处理时间为4‑24h。本发明利用不同浓度LPS作用不同时间，通过MTS检测细胞存活率，检测细胞因子TNF‑α，IL‑6和IL‑1β的分泌，检测NO的释放等指标，为探究LPS体外诱导RAW264.7细胞炎症与免疫之间的关系和免疫相关疾病的发生机制提供了理论基础，同时也为深入研究炎症的感染机制和开发用于炎症感染的制剂提供技术基础和理论参考。

技术领域

本发明涉及一种免疫细胞炎症模型的建立方法。特别涉及一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法。

背景技术

炎症反应是伴随多种疾病状态的一种共有的病理现象，在有血管分布的组织或细胞在应对损伤性刺激时，通过释放炎性介质所发生的防御反应，具有杀灭病原体，限制感染和修复损伤等作用。炎症反应通常需要精确调控，反应紊乱会造成组织损伤危害机体，严重时可危及生命。炎症疾病具有易反复，难治愈等特点，因此建立炎症模型对炎症药物的筛选和炎症性疾病的治疗有实际意义。

目前的炎症实验模型主要有分子水平，动物水平与细胞水平。分子水平靶向性明确但无法对生物活性进行评价；动物模型可以用于研究炎症的机制但成本较高，周期长。细胞炎症模型与动物与分子水平相比成本低且周期短易操作，能明确反映炎症发生的过程。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种内毒素，组织或细胞感染后作为重要的抗原分子被抗原递呈细胞(APC)捕获从而引起机体的免疫反应。巨噬细胞是参加炎症反应的中心细胞，具有吞噬，分泌和抗原呈递等作用，是炎症细胞因子的主要来源。因此，建立细胞水平上的炎症模型对研究炎症的发生机制和开发抗炎制剂具有重大的意义。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，为深入研究炎症的感染机制和筛选抗炎制剂提供技术基础和理论参考。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，采用LPS体外处理RAW264.7细胞，LPS浓度是1-1000ng/ml，处理时间为4-24h。

所述LPS浓度是100ng/ml，感染时间为16h。

上述LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型的建立方法，包括以下步骤：

设置空白组、对照组和实验组。在96孔板中空白组加入100μl培养基，实验组与对照组加入密度为5.0×10⁴cells/ml的RAW264.7细胞，每孔90μL。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育24h后，对照组每孔加入10μl培养基，实验组中加入10μl LPS溶液。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育24h，每孔加20μLMTS孵育2小时，酶标仪振荡10s，在490nm处测定吸光度值。

设置细胞对照组和实验组，将细胞浓度调节为5×10⁵个/ml，每孔1.8ml接种于24孔板中，对照组加入200μl细胞培养液，实验组分别加入200μl LPS溶液，在37℃，5％CO₂条件下培养24h。

收集细胞上清液，用于测定炎症细胞因子的相关指标。

实验组中LPS浓度为1ng/ml，10ng/ml，100ng/ml，1000ng/ml。

在培养后第4h，8h，16h，24h收集细胞上清液。

相关指标包括NO，TNF-α，IL-6和IL-1β。