[发明专利]一种基于测定环境胁迫下斑马鱼M受体的奇数受体亚型表达评估水质的方法

说明书

本发明提供一种基于测定环境胁迫下斑马鱼M受体的奇数受体亚型表达评估水质的方法。本发明通过实时荧光定量PCR技术快速检测斑马鱼眼部M受体奇数受体的表达量的变化，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，在线监测反应过程，结合相关的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。本发明所述方法较其他的方法灵敏度更高，可以达到相对定量或绝对定量的目的，并且通过对斑马鱼M受体奇数受体表达量变化的检测，进而实现快速水质评估的目的。

技术领域

本发明属于分子生态学技术领域，具体涉及一种基于测定环境胁迫下斑马鱼M受体的奇数受体亚型表达评估水质的方法。

背景技术

随着社会经济的快速发展以及人口的迅猛增长，水污染问题日益严重，直接危害到我们的正常生活，世界各国都面临着淡水资源短缺的问题。我国作为一个人口大国，人均淡水量较低，又由于工业废水，废渣的排放，农业化肥农药的滥用，生活污水和生活垃圾的乱倒，导致地下水和河流的严重污染，可用的淡水资源越来越少，水资源短缺问题受到人们的广泛关注，国家也制定了相应的法律法规来监管和治理，相应的水质评估和监测也成为研究热点。

目前水质评估的方法很多，包括物理、化学检测，生物监测等。随着科技的发展和社会的需求，快速水质评估越来越受到广大学者的青睐，其中，主要使用斑马鱼来作为受试生物。斑马鱼具有易饲养，繁殖快，成本低，胚胎外部发育，以及与人类基因具有87％的高度同源性等优点，使其成为国际标准模式生物，常可用于水质环境的评估和监测。人们通过对斑马鱼的死亡率、致畸率，行为变化，代谢变化等来测定受到环境损伤后斑马鱼的变化，并以此来进行水质的评估和监测等。但是，斑马鱼这些指标的变化都受到内在神经的支配，具有一定的延时性。M受体这一神经递质(乙酰胆碱)受体表达在受到外界环境胁迫后必然会发生变化，因此考虑采用M受体蛋白表达变化量来进行水质的评估。但是由于目前尚未找到斑马鱼相应的M受体抗体，无法直接进行斑马鱼M受体蛋白活性的测定。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明通过实时荧光定量PCR技术快速检测斑马鱼眼部M受体奇数受体的表达量的变化，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，在线监控反应过程，结合相关的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。本发明所述方法较其他的方法灵敏度更高，可以达到相对定量或绝对定量的目的，并且通过对斑马鱼M受体奇数受体表达量变化的检测，进而实现快速水质评估的目的。

本发明的目的之一是提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体中的应用。

本发明的目的之二是提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体的方法。

本发明的目的之三是提供上述方法在水质评估与监测中的应用。

为实现上述目的，具体的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体中的应用。

其中，所述斑马鱼为成年斑马鱼，进一步优选的，斑马鱼鱼龄为3～6个月；

进一步的，所述斑马鱼M受体奇数受体的提取检测部位为眼部；

进一步的，所述斑马鱼M受体奇数受体包括但不限于M1a，M1b，M3a，M3b，M5a，M5b；更进一步的，所述斑马鱼M受体奇数受体为M5b；

本发明的第二个方面，提供一种荧光定量PCR在快速检测斑马鱼M受体奇数受体的方法，所述方法为：

S1.提取斑马鱼总RNA；

S2.cDNA克隆：对提取的总RNA进行反转录得cDNA；

S3.荧光定量PCR：进行PCR扩增，得到扩增曲线和溶解曲线，并对数据进行分析，进而得到M受体奇数受体表达量的变化；