[发明专利]基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒及其专用引物对组合

说明书

本发明公开了基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒及其专用引物对组合。本发明提供的引物对组合，由序列表中序列1至序列248所示的248种DNA分子组成。实验证明，采用本发明提供的基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒检测人类基因组DNA的124个微单倍型基因座，分型结果准确。本发明提供的试剂盒具有重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及法医学技术领域，具体涉及基于二代测序技术同步检测124个微单倍型基因座的试剂盒及其专用引物对组合。

背景技术

以法医学和遗传学为基础学科背景的法医DNA技术在刑事案件侦查举证、打击拐卖妇女儿童、灾害遇难者及失踪人员身份认定、民事亲权关系鉴定等领域具有广泛应用。基于毛细管电泳平台进行STR分型是当今法庭科学领域个体识别的金标准。经过近三十年的积累，法医DNA学界已经可以很好的解决血液、唾液、精液、骨骼、肌肉等常规生物检材的DNA检验问题，但两人或多人混合DNA检验分型仍然是法医物证领域公认的技术难题之一。PCR扩增是STR检验的必要实验环节之一，然而由于STR是重复序列，在扩增过程中会由于复制滑脱伴随出现影子峰(stutter peak)。影子峰是重复序列复制的固有现象，没有办法去除。实际工作中发现，影子峰主要出现在比目的等位基因减少一个重复单元的位置，峰高或峰面积占目的等位基因的比例不等(通常在3％-15％)，但在比目的等位基因增加一个重复单元和减少两个重复单元的位置也可能出现。影子峰的存在，对单一样本的正确分型不会产生严重的影响，但对于混合样本分型的干扰非常严重。特别是在极端混合比例DNA样本中，微量成分的目的峰与主要成分的影子峰非常相似，雌雄莫辨，严重干扰混合分型拆分。因此，有必要考虑使用其它遗传标记辅助解决混合DNA样本的检验问题。

2010年，葛建业等人提出单倍型域(haplotype block)概念，单倍型域指包含一系列相邻、紧密连锁且共同遗传的SNP，若将多个SNP整合为一个遗传标记，将会显著提高SNP遗传标记的鉴别能力。2013年，美国耶鲁大学Kenneth Kidd教授的研究团队首次将微单倍型(microhaplotype)遗传标记引入法庭科学领域，其定义是在200bp范围内2-5个SNP的组合。SNP遗传标记不存在影子峰现象，在精准医疗、种族地域推断、表型特征刻画等领域应用广泛，但由于其是二等位基因遗传标记，在混合DNA分型中作用有限。微单倍型兼具STR和SNP遗传标记的优势。微单倍型为多等位基因遗传标记，且不存在影子峰干扰，在混合DNA检验领域具有巨大潜力，而且，比STR突变率更低，扩增子更短，适于法医遗传学应用。

微单倍型和SNP均属于序列多态性遗传标记。虽然SNP遗传标记可通过长度差异PCR引物或SNaPshot分型方法转化为长度多态性，进而利用毛细管电泳平台检测，但包含多个SNP的微单倍型遗传标记却很难转化为长度多态性，所以法医DNA常用的毛细管电泳方法并不适用于微单倍型遗传标记检测。一种可行的办法是首先检测实验样本的SNP位点，再通过Phase软件处理数据获得相应群体中微单倍型基因座的基因型以及等位基因频率等参数。以上方法属于间接的微单倍型分型方法，并不能直接获得微单倍型分型，在一定程度上减缓了研究的进程。

二代测序，也称下一代测序(Next Generation Sequencing，NGS)或大规模并行测序(Massively Parallel Sequencing，MPS)，在科研和临床诊断领域已得到广泛应用。相比传统的DNA测序方法，二代测序技术具有高通量、高速度、集成化、低成本等显著优势，在法医遗传学领域也具有重要应用前景。测序技术是序列多态性遗传标记最好的检测手段。微单倍型是SNP的线性组合，其本质仍然是SNP，二代测序技术能够一次性获得复合体系中SNP位点的全部基因分型，也同时获得全部微单倍型遗传标记的准确分型，学者普遍认为二代测序将会是微单倍型检测的金标准。目前已有研究团队采用二代测序平台对微单倍型进行研究，为微单倍型遗传多态性提供了初步数据，对微单倍型遗传标记应用于个体识别、亲权鉴定及种族推断的可行性进行评估。