[发明专利]肺癌的双靶点CAR-T治疗载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括CEA单链抗体、GPC3单链抗体和趋化因子CCL19三个特异性结构，

其中，CEA单链抗体核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，

GPC3单链抗体，由GPC3单链抗体重链V_H、Inter-Linker、GPC3单链抗体轻链V_L三部分构成，其中，GPC3单链抗体重链V_H的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Inter-Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，GPC3单链抗体轻链V_L的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

趋化因子CCL19核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述的一种嵌合抗原受体，其特征在于，嵌合抗原受体结构组成为Igkappa-iRGD-CEAscFv-(G₄S)₅-GPC3V_H-(G₄S)₃-GPC3V_LscFv-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19。

3.根据权利要求2所述的一种嵌合抗原受体，其特征在于，

iRGD核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，

CEAscFv表示CEA单链抗体，

(G₄S)₅为单链抗体间铰链Inner-Linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，

GPC3V_H表示GPC3单链抗体重链V_H，(G₄S)₃表示Inter-Linker，GPC3V_LscFv表示GPC3单链抗体轻链V_L，

CD8α为跨膜区，连接胞外抗原结合域和胞内信号域，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，

CD28-CD137为共刺激结构域，CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，CD137核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，

CD3ζ为信号转导域，核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，

T2A为linker，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.一种肺癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，包含权利要求1-3中任一项所述嵌合抗原受体，以及载体。

5.根据权利要求4所述肺癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，所述载体包括PUC19质粒、慢病毒表达载体。

6.根据权利要求5所述肺癌的双靶点CAR-T治疗载体，其特征在于，所述慢病毒表达载体为pCDH-EF1α-MCS-(PGK-Puro)。

7.一种如权利要求5或6所述肺癌的双靶点CAR-T治疗载体的构建方法，其特征在于，

将嵌合抗原受体结构按照基因序列，采用常规生物合成方法进行合成，合成后存在于PUC19质粒载体上；将PUC19质粒载体和慢病毒表达载体均采用ECoRⅠ、NotⅠ双酶切，将酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的条带，得出载体和目的片段的浓度，将两者按照摩尔比为1:5进行连接转化，质粒提取，最终获得含有嵌合抗原受体结构的重组质粒，即所述肺癌的双靶点CAR-T治疗载体。

8.一种如权利要求5或6所述肺癌的双靶点CAR-T治疗载体的应用，其特征在于，用于构建CAR-T细胞，

将该治疗载体采用三质粒包装系统进行慢病毒包装，组成为PSPAX2、pMD2G、肺癌的双靶点CAR-T治疗载体，使用293T细胞作为慢病毒的包装细胞，培养，收集病毒液，将此病毒液浓缩后，感染T细胞，即可获得CAR-T细胞。