[发明专利]针对人源ADRB2基因设计的四条sgRNA

说明书

本发明属于基因修饰技术领域，公开了针对人源ADRB2基因设计的四条sgRNA序列。登录网站检索人源ADRB2基因的CDS序列，根据sgRNA的设计原则，在其CDS区近5’端采取头对头的排列方式，设计了四条sgRNA。在此基础上，分别构建了单sgRNA表达质粒和多重sgRNA载体。经T7EN1酶切鉴定和TA克隆测序证实两种质粒转染HEK293T细胞后均可引导Cas9蛋白切割靶基因，特别是多重sgRNA其基因修饰的效率可高达100％。

技术领域

本发明属于CRISPR/Cas9基因编辑技术领域，具体是指针对人源ADRB2基因设计的四条sgRNA。

背景技术

基因编辑技术，是近年来发展起来的一项可以对基因进行精准修饰的技术。在科学研究领域，基因编辑技术可用于模式生物的快速构建；在农业领域，该技术可用于植物品种改造；而在健康医疗领域，该技术还有可能通过改造人类自身基因，达到治疗疾病的目的。因此，基因编辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。

目前，基因编辑技术主要有锌指核酸酶(ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复技术(CRISPR/Cas9)。技术原理上，三种基因编辑技术都是通过特异序列的靶向识别和切割，造成基因组断裂，在细胞通过非同源末端连接修复(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组修复(HR)的过程中达到对基因精确修饰的目的。

锌指核酸酶作为第一代基因编辑技术，首次实现了对基因的靶向性操作。原理如下：锌指核糖核酸酶由一个DNA识别域和一个核酸内切酶构成。DNA识别域又是由一系列锌指蛋白模块串联组成，每个锌指蛋白模块识别并结合一个特异的三联体碱基，从而实现核酸内切酶对基因组特定位点的靶向性切割。尽管有文献报道锌指核酸酶的基因打靶效率能达到30％，但其发展仍存在较大局限性。一方面，锌指核酸酶的识别结构域中存在上下文序列依赖性，增加了设计、筛选难度；另一方面，锌指核酸酶的脱靶切割会导致细胞毒性，制约了其在基因治疗领域的应用。

转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)是第二代基因编辑技术，TALEN在设计上比ZFN更加简单，使用上更加灵活。TALEN的作用原理与ZFN相似，但其特异性识别DNA序列的是TALEN蛋白。TALEN蛋白利用其重复单元中第12/13位氨基酸残基于A、G、C、T形成的保守且恒定的对应关系，进而实现对基因组上任意特定位点的识别、切割。

CRISPR/Cas9是新近发展起来的第三代基因编辑技术，它来源于细菌和古细菌的适应性性免疫系统。前两代基因编辑技术不同，CRISPR/Cas9系统是RNA介导的Cas9核酸内切酶对特定DNA序列进行识别、切割，进而实现对基因组的精确编辑。其中，起向导作用的RNA被称为sgRNA(single-guide RNA)。它由两部分构成，一部分是crRNA(CRISPR RNA)，其通过碱基互补配对原则与靶序列结合，起精准定位的作用，另一部分是tracrRNA(trans-acting CRISPR RNA)，其协助crRNA/Cas9蛋白形成稳定的复合物，实现Cas9在基因组上的精准定位，进而剪切DNA双链，形成DSB(Double Stranded Breaks)缺口，激活细胞自身的DNA损伤修复机制，在修复的过程中造成移码突变，最终实现靶基因的敲除。

CRISPR/Cas9系统一经出现便在基础研究领域及研发领域得到广泛应用，主要是它有着前两代基因编辑技术无可比拟的优势。首先，其构建过程简单，可操作性强，成本低。其次，可以实现单基因多位点或多基因的同时敲除，大大提高了基因编辑的效率。再次，质粒载体体量小，减少了转染过程中的细胞毒性。最后，可供编辑的位点在基因组上出现频率高，容易选择合适的位点进行高效基因编辑操作。除此以外，与目前基因沉默领域应用最为广泛的基因干扰技术(RNAi)相比，CRISPR/Cas9同样优势显著：

发明内容