[发明专利]一种酶法催化高产α-酮异己酸的方法

说明书

本发明公开了一种酶法催化高产α‑酮异己酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过分子生物学手段构建了一株异源表达来自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)脱氨酶基因的工程菌。再以亮氨酸为底物，利用重组菌全细胞转化生产α‑酮异己酸。通过各种优化手段，实现了α‑酮异己酸的高效生产。通过本发明生产的α‑酮异己酸产量可达61.5g/L，转化率达到95.7％，时空产率为3.1g/L/h。

技术领域

本发明涉及一种酶法催化高产α-酮异己酸的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

α-酮异己酸(KIC)，别名酮亮氨酸，是支链氨基酸亮氨酸的前体物质，是重要的有机合成，药物合成中间体，广泛应用在制药、食品和化学工业。目前KIC的生产方法包括化学合成法、发酵法和生物催化法。化学合成法主要包括乙酰氨基肉桂酸水解法、乙内酰脲与苯甲醛合成法和海因法。但化学合成法对设备要求高，例如高温、高压等，产品得率低，后期分离纯化难度大，并且有的合成过程中会产生有毒有害的物质，对环境造成了污染。目前，有文献报道KIC可以直接通过谷氨酸棒杆菌发酵生产，但是产量只有9.23g/L，不仅产量低，而且发酵成本高，发酵过程会产生不同种类的副产物，不利于后期产品的分离纯化。2015年，有研究者建立了酶法转化亮氨酸生产α-酮异己酸这一路径，最高产量可以达到69.1g/L，但转化率为50.3％，不适于大规模的工业化生产。

L-氨基酸脱氨酶(L-AADs,EC1.4.3.2)又名L-氨基酸氧化酶(L-AAO)，多为黄素蛋白，二聚体结构，每个亚基非共价结合一个黄素嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子。L-AADs能特异性催化L-氨基酸氧化脱氨基，经过亚氨基中间体，生成相应的酮酸和氨，还原型辅因子(FADH₂)经再次氧化生成过氧化氢或水。L-AADs广泛存在于哺乳动物、蛇毒、昆虫毒素、海兔、真菌、细菌及藻类中。蛇毒L-AADs是这类酶家族中被研究最透彻的成员，但是由于制备困难，较难大规模使用。来自于细菌和真菌的L-AADs对大部分氨基酸具有催化活性，但是反应过程中生成过氧化氢，对细胞有毒害作用，不利于转化的进行。来自于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的脱氨酶其定位在细胞膜当中，这类酶与细胞膜上的电子传递链相关，电子经过电子传递链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，该过程不产生过氧化氢，这为异源表达氨基酸脱氨酶转化L-亮氨酸生产α-酮异己酸提供了可能。

发明内容

本发明旨在通过异源表达一种L-AAD用于全细胞转化生产α-酮异己酸，这种转化生产过程条件温和，对设备要求低，只需一步反应，简便快捷，效率高。转化的过程中不用额外添加其他化学物质或者生物辅因子，降低了成本，减轻了对环境的污染。反应具有高选择性，产品纯度高，方便后期的分离与纯化，有利于大规模的工业化生产。

本发明的第一个目的是提供一种产氨基酸脱氨酶的基因工程菌，能够表达SEQ IDNO.1所示的编码氨基酸脱氨酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α、E.coli TOP10中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列的质粒为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以E.coli BL21(DE3)为宿主，以pET-28a(+)为表达载体。

本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌在食品、生物、医药领域的应用。

本发明的第三个目的是提供一种构建高产α-酮异己酸的重组菌的方法，是表达了来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶，编码所述脱氨酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。