[发明专利]一种内源L-门冬酰胺酶II基因敲除的宿主菌、其制备方法及其应用

权利要求书

1.一种重组表达外源基因的大肠杆菌，其特征在于大肠杆菌基因组不含有编码内源L-门冬酰胺酶II的基因，所述编码内源L-门冬酰胺酶II的基因通过自杀质粒介导的基因敲除技术被敲除，所述大肠杆菌是通过打靶载体敲除细菌中内源L-门冬酰胺酶II基因的表达功能框，所述打靶载体包含如SEQ ID NO:1所示的打靶序列；

所述大肠杆菌进一步包含表达外源基因产物的多核苷酸；所述的多核苷酸选自通过游离于所述大肠杆菌基因组的重组表达载体表达，或通过定点整合到所述大肠杆菌基因组上表达；所述外源基因为外源L-门冬酰胺酶II，所述的外源L-门冬酰胺酶II选自序列如SEQID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的L-门冬酰胺酶II。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌选自大肠杆菌BL21（DE3）、BLR（DE3）、Rosetta（DE3）、Origami（DE3）、JM109、HSM174（DE3）、AS1.357和DH5α菌株。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于所述大肠杆菌是大肠杆菌BL21（DE3）。

4.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于所述重组表达载体为pET9a，信号肽为选自如SEQ ID NO：5或6的信号肽序列。

5.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其特征在于所述打靶序列可操作地连接于自杀质粒pCVD442。

6.根据权利要求1所述的大肠杆菌，所述打靶载体通过以下引物组获得，所述引物组序列如下表所示：

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