[发明专利]一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括NID2正向引物序列为如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列为SEQ ID NO.2，荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB；此外还包括检测GAPDH的正向引物及探针，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH₂O。本发明所用试剂盒检测灵敏性、特异性强。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法。

背景技术

膀胱癌(bladder cancer，BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，占泌尿系肿瘤的首位，其发病率和复发率呈逐年增加的趋势。据统计，我国每年约有145 000例患者死于膀胱肿瘤，其中男性发病率为女性的3～4倍。在来源于上皮组织的膀胱癌中，约90％为移行上皮癌；非上皮性膀胱肿瘤较少见，主要包括未分化癌、鳞状细胞癌、腺癌，根据细胞的分化程度可将其分为3级。浅表性膀胱癌早期诊断通常有较好的预后，然而，膀胱癌的复发率为60％～70％，居所有实体瘤的首位，其中11％的复发患者会发展为浸润性膀胱癌，患者术后通常需每年进行3～4次膀胱镜检查。早期发现膀胱癌可以增加手术保留膀胱的机会并提高患者总体生存率，因此，如何早期发现膀胱肿瘤以及术后如何早期检测到膀胱肿瘤的复发具有非常重要的临床意义。

传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，其结果可能会受操作者主观判断而带来一定的误差；而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此无创检测，高灵敏高特异性是未来膀胱癌检测和监控手段发展的方向。

膀胱癌无创检测的关键在于寻找高灵敏高特异性生物标记物，目前这也是膀胱癌研究的一大热点。中国专利(CN104141009B)公开了一种早期膀胱癌的多靶标检测方法，通过甲基化特异性荧光定量PCR对EOMES、GDF15、NID2、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154这七个标志物基因进行检测。其中，NID2的检测灵敏度仅为23.33％。通过检测多个标志物基因的甲基化水平，虽然可以有效提高对膀胱癌检测的灵敏度，但是由于做甲基化特异性荧光定量PCR所用试剂、仪器都较为昂贵，检测费用较高，无疑增加膀胱癌患者的就诊负担。因此，寻找灵敏度、特异性高，无需多个标志物同时检测，可降低检测费用的检测膀胱的方法或产品，是众多膀胱癌患者所亟需的。

发明内容

本发明主要目的是，提供了一种用于早期膀胱癌检测的试剂盒及其使用方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明目的之一，提供一种用于早期膀胱癌检测的引物及探针，所述引物序列如下：NID2的正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述荧光探针序列为SEQ ID NO.3，探针5′端标记FAM，3′端标记MGB。

本发明目的之二，提供所述引物及探针在制备用于早期膀胱癌检测的试剂盒的应用。

本发明目的之三，提供一种试剂盒，其包括以上所述的引物及探针；此外还包括检测GAPDH的引物及探针，PCR Master Mix，裂解液，蛋白酶K，漂洗液，亚硫酸氢盐溶液和ddH₂O。

本发明目的之四，提供一种上述试剂盒的使用方法，步骤如下：

(1)样本中基因组DNA的提取：取患者尿沉淀细胞，利用裂解液，蛋白酶K，漂洗液和ddH₂O提取，得基因组DNA溶液；

(2)DNA甲基化修饰：取步骤(1)提取得到的基因组DNA溶液用亚硫酸氢盐溶液进行修饰，得到甲基化修饰后的DNA；

(3)将步骤(2)修饰后的DNA进行PCR扩增。