[发明专利]用于构建陆地棉品种指纹图谱的SSR引物及其应用

说明书

本发明公开了用于构建陆地棉品种指纹图谱的SSR引物及其应用，属于陆地棉品种的分子生物学鉴定领域。本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD上释放获得的棉花EST序列数据设计并初步筛选获得268对SSR引物。本发明利用中棉所6个杂交种的6对亲本对所设计引物的扩增效果进行筛选，结果其中有106对引物具有差异效果。本发明进一步对上述106对引物进行筛选，选出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种的特异指纹图谱或构建国审陆地棉品种分子身份证。本发明还公开了所述的SSR引物在构建陆地棉品种分子身份证或者构建陆地棉品种指纹图谱中的应用。

技术领域

本发明涉及用于构建陆地棉棉花品种指纹图谱的SSR引物，还涉及所述SSR引物在建立陆地棉花棉品种分子身份证或指纹图谱中的应用，属于陆地棉品种的分子生物学鉴定领域。

背景技术

目前，每年申请参加黄河、长江及西北内陆三大流域国家审定的陆地棉新品种(系)多达上百个。很多新品种特别是同一地方选育出来的新品种(系)，大多利用少数优良常规品种作为亲本，品种的遗传基础相对狭窄；因此，利用形态特征、生理特性等来鉴定品种的纯度和真伪较为困难。基于此，近年来，棉种市场上F2代冒充F1代杂种，或者在F1代杂种中掺有大量亲本种子的事实不断出现，使棉农蒙受损失。如何鉴别棉种的真伪、品种纯度成为一个亟待解决的问题。

DNA分子标记的出现和快速发展，为棉花品种的准确鉴定提供了一种新的技术手段。简单重复序列(Simple sequence repeat，SSR)分子标记具有数量丰富、共显性遗传、信息含量高、分析方法简单、结果重现性好等优点，使其成为构建品种分子身份证的较理想的分子标记技术，并且已成功应用于大豆、玉米、小麦、水稻、棉花等作物中。以此方法构建品种的分子指纹图谱、鉴别品种的真伪和纯度，对种子产业化和品种的知识产权保护有重大意义。但这种方法存在成本偏高、耗时、且一次检测位点较为有限等不足。因此，开发一种快速构建国家审定的陆地棉品种分子身份证或指纹图谱的方法，具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于构建陆地棉品种指纹图谱的SSR引物；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述的SSR引物在构建陆地棉品种分子身份证或者指纹图谱中的应用。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明根据GenBank dbEST数据库及专业棉花数据库CMD(cotton markerdatabase)上释放获得的棉花EST序列数据进行SSR引物的设计，并根据设计引物的稳定性、渗透性、产物的大小以及前后引物的Tm值差异进行了初步筛选，获得268对引物。本发明利用中棉所6个杂交种的6对亲本，对所设计的268对引物的退火温度及扩增效果进行了初步筛选，结果在268对引物中有248对引物扩增出明确条带，其中106对为具有差异效果的引物(表现形式主要以条带长度不一致)，在总引物中占据了40％的比例，证明本发明所述SSR引物具有一定的多态性。

本发明进一步通过对中棉所6个杂交种样本进行SSR扩增反应，对上述106对引物在12个亲本品种中具有差异效果的特异SSR标记进行筛选。最终，本发明从上述106对具有疑似差异扩增效果的引物中，选择出差异较为稳定、多态性好的15对核心引物，加上一对Bt基因特异引物，用于构建棉花品种的特异指纹图谱或国审陆地棉品种分子身份证。

本发明所述的15对核心SSR引物及一对Bt基因特异引物，包括：由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的下游引物组成的引物对1(即引物M003)；

由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列为SEQ ID No.4所示的下游引物组成的引物对2(即引物M006)；