[发明专利]人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体，在pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间构建有人蛋白基因Notch3胞内片段序列。据此，还建立了相应构建方法。实验结果显示，使用该测序验证后的过表达质粒转染的细胞经qPCR检测和蛋白质免疫印迹检测，均可在细胞中特异性高表达N3ICD的mRNA及蛋白，测定结果清晰准确，价格低廉，大幅缩减实验成本。因此，本发明构建的N3ICD过表达载体可以作为现成的亚克隆模板，参与到过表达载体构建和过表达慢病毒包装中，为心肌系统疾病的研究带来巨大便利。本发明有效解决了人源N3ICD片段克隆困难和在细胞系中高表达的问题，为Notch3基因通路研究提供了实验基础。

技术领域

本发明属于细胞基因工程领域，尤其涉及一种人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用。

背景技术

Notch基因于1917年在果蝇体内被发现，因其基因的部分缺失会在果蝇翅膀的边缘造成缺口(Notch)而得名。Notch信号通路在大部分脊椎和非脊椎动物中都存在，有较高程度的保守性。既往研究表明，Notch受体与配体可以在相邻细胞间结合，传递Notch信号，从而对器官形成和形态产生影响。研究表明，Notch信号通路的改变与肿瘤、遗传性疾病、神经退行性疾病以及心血管病变等的发生、发展密切相关。

在人体中，Notch基因存在四种亚型分别是Notch 1、2、3、4。成熟的Notch受体蛋白由胞外结构域(extracellularnotch，ECN)、跨膜结构域(notch transmembrane，NTM)和胞内结构域组成。胞外结构域通过其具有的3个串联Lin/Notch重复序列(Lin/Notchrepeats，LNR)以非共价键的形式与跨膜结构域相互结合形成异二聚体。此外，胞外结构域中还包含一个表皮生长因子样重复序列(epidermal growth factor-like repeats，EGF-R)，通常作为配体结合位点发挥相关生理作用。

在信号传导过程中，激活后的Notch受体蛋白会发生多次剪接切，此时Notch胞内区域(notch intra cellular domain，NICD))会从细胞膜上被剪切下来，进入细胞核与核转录因子结合，激活下游靶基因转录而发挥一系列生物学作用。

Notch3主要表达于平滑肌细胞中，经证实与心肌重构、心动脉平滑肌细胞的分化与成熟等有关，是研究心血管相关发育缺陷和生理疾病的重要基因。Notch3基因胞内片段由于其碱基序列GC值含量较高，极易在分子克隆过程中形成二级结构或发卡结构而影响扩增过程，普通分子克隆酶无法获得目的片段。此外，目前市场上已有的N3ICD载体价格昂贵，这些现状都为Notch3信号通路的研究带来了巨大阻碍，影响了研究工作的开展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人蛋白基因Notch3胞内片段克隆载体及其制备方法和应用，为子心肌系统疾病的相关研究提供巨大便利。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

人蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体，在pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间构建有人蛋白基因NOTCH3胞内片段(N3ICD蛋白片段)序列。

人蛋白基因NOTCH3胞内片段来自Notch3基因(人细胞系hela)，其具有序列表SEQ.ID.NO.1的碱基序列，其编码的蛋白具有序列表SEQ.ID.NO.2的氨基酸序列。

碱基序列在第533位和1820位碱基存在氨基酸同义突变。

上述蛋白基因NOTCH3胞内片段克隆载体的制备方法，将人蛋白基因NOTCH3胞内片段碱基序列克隆到pcDNA3.1载体的KpnI和XbaI酶切位点之间，KpnI酶切位点位于碱基序列的上游，XbaI酶切位点位于碱基序列的下游，从而构建成为可以完成细胞瞬转过表达的N3ICD-pcDNA3.1过表达载体。