[发明专利]一种热处理去除PCV2 VLPs中非VLPs蛋白的方法

权利要求书

1.一种热处理去除PCV2VLPs中非VLPs蛋白的方法，具体步骤如下：

1)E.coliBL21(DE3)/pET28a-cap摇瓶表达；

2)制备PCV2VLPs粗样品；

3)对大肠杆菌表达、制备的PCV2VLPs样品进行热处理；

4)离心分离热处理后的PCV2VLPs上清和沉淀，并对处理前后PCV2VLPs样品进行SDS-PAGE检测、琼扩效价检测、电镜检测；所述的步骤3)中的热处理为65℃、30-50min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的热处理为65℃、30min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中表达宿主菌为E.coliBL21(DE3)。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中E.coliBL21(DE3)/pET28a-cap摇瓶表达的步骤为：接种20μLE.coliBL21(DE3)/pET28a-cap甘油菌到装有5mL含终浓度50μg/mLKana的LB液体培养基的试管中，37℃200rpm摇床培养过夜；按2％接种量转接4mL过夜培养的E.coliBL21(DE3)/pET28a-cap菌液到装有200mL含终浓度50μg/mLKana的LB液体培养基的500mL锥形瓶，37℃200rpm摇床培养；至OD600＝0.6时，加入0.4mMIPTG，37℃200rpm摇床培养，诱导表达3h；诱导结束8000rpm10min4℃离心收集菌体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中制备PCV2VLPs粗样品的步骤为：按1g湿菌/10mLPBS重悬菌体，超声波破碎，破碎功率为300W，工作3s间歇5s，共破碎10min；12000rpm20min4℃离心分离破菌上清和沉淀，取破菌上清用60％饱和度硫酸铵沉淀4h，12000rpm10min4℃离心收集沉淀，再用等体积PBS重悬，即为PCV2VLPs粗样品。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中所述的对大肠杆菌表达、制备的PCV2VLPs样品进行热处理的步骤为：将步骤2)中制备的PCV2VLPs粗样品分装到1.5mLEP管，1mL/支；将分装的PCV2VLPs粗样品置于65℃水浴锅中水浴30-50min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中所述的琼扩效价检测步骤为：琼脂板的制备，1g琼脂糖加入100mLPBS缓冲液中，水浴加热融化，稍凉45～60℃倒入平皿中，厚度约为3mm，待琼脂糖凝固后加盖，将平皿倒置，以防水分蒸发，放入4℃冰箱中保存备用；打孔，将琼脂板放在预先画好的图样上，用六角形打孔器在琼脂板上按7孔梅花图案打孔，孔径3mm～4mm，孔距3mm，用针头挑出孔内琼脂，挑出时从孔一侧边缘插入针头，轻轻移动，等空气进入孔底后，再向上挑出，勿伤边缘；封底，打孔完毕，封闭孔底将板底部在酒精灯上烘烤，使底部琼脂微溶化即可，也可在琼脂孔底部与板接触处加少量溶化的琼脂糖，以防侧漏；加样，用微量移液器滴加阳性血清于中间孔，设阴性对照孔，其余孔加被检抗原，加样时应将孔加满，不应出现凹形面，也不应溢出，在本次实验中中间孔为抗原，周围孔为阳性血清；感作，将加好样的琼脂板，静置5～10min，待孔内液体吸收，将琼扩板加盖保湿，放于37℃温箱内作用24、48、72h观察沉淀线。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤4)中电镜检测制样步骤为：铜网经过10-30s的等离子清洗，碳面朝上；将一块封口膜铺在冰盒上冷却；将铜网放在冰的封口膜上；封口膜上分别滴样品、超纯水、PTA染液各20μL；放置1-2min，将铜网、样品、超纯水、PTA冷却；将铜网碳面扣在样品液滴上吸附样品1min，用滤纸与铜网垂直接触吸掉多余液体，直至看不到残留液体，持续吸水10s；将铜网碳面扣在PTA液滴上染色0.5-1min，用滤纸吸干；放置在滤纸上，在阴凉处自然干燥，即可用于电镜观察。