[发明专利]一种抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法

权利要求书

1.一种抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：所述抑菌剂为天然肉桂醛精油（> 95%）；所述链格孢菌株（A-0913）分离纯化于红提葡萄果实，保存于湘潭大学生物与食品工程专业实验室；所述真菌毒素为AOH和AME。

2.一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：利用肉桂醛直接接触抑制采后葡萄链格孢菌生长，此方法包括如下步骤：

（1）制备马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），将PDB培养基分装至150 mL锥形瓶中，每瓶100 mL，再向锥形瓶中加入吐温-80使其浓度为0.5%，于121 °C下，高压蒸汽灭菌 20 min；

（2）待所述步骤（1）中培养基灭菌完成后将其冷却至40-50 °C，加入肉桂醛使其终浓度分别为 0.00、0.0125、0.025、0.050、0.100和0.200 μL/mL，充分振荡摇匀；

（3）用6 mm的圆形打孔器在培养5 d的链格孢培养皿中打下菌苔，取2块菌苔接种到所述步骤（2）的锥形瓶中，于25 °C、150 rpm条件下振荡培养；

（4）培养96 h后取出所述步骤（3）中链格孢菌丝，无菌水冲洗3次后用无菌纱布过滤，然后置于80 °C干燥箱中直至恒重状态，随后对菌丝进行称重，并计算肉桂醛对链格孢菌丝生长的抑制率。

3.一种如权利要求1所述抑制采后葡萄链格孢菌生长及降解其体内真菌毒素的方法，其特征在于：利用肉桂醛熏蒸抑制采后葡萄果实中链格孢菌的生长，此方法包括如下步骤：

（1）在超净工作台上将健康的葡萄果实用75%酒精进行表面消毒3~5 s，再放入0.1%次氯酸钠溶液中消毒2 min，最后用无菌水冲洗3次，晾干；

（2）用解剖刀在所诉步骤（1）中葡萄果实的赤道附近划一个1 cm×1 cm的伤口，再用移液枪吸取20 μL病原菌菌悬液（1×10⁶ CFU/mL）置于伤口上，未接种病原菌的葡萄果实作为对照组；

（3）将所述步骤（2）中处理后的葡萄果实分别置于含0、0.2 和2.0 μL/mL肉桂醛的密闭保鲜盒内，保鲜盒底部放有湿润的无菌纱布，置于4 °C恒温恒湿培养箱中培养至葡萄果实明显腐烂为止，观察放置过程中葡萄腐烂情况并拍照保存。

4.一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：用肉桂醛降解链格孢菌丝体体内真菌毒素，此方法包括如下步骤：

（1）用直径为6 mm的无菌打孔器在培养5 d的链格孢菌平板上打下菌苔，取两块菌苔放入100 mL 灭菌的马铃薯葡萄糖培养基（PDB）中，于25 °C、150 rpm振荡培养3 d；

（2）取出所述步骤（1）中的菌丝体，经四层纱布过滤后称取0.5 g 于研钵中研磨均匀；

（3）将所述步骤（2）中的菌丝体转移到10 mL离心管中，加入4 mL所述步骤（2）中的滤液，然后加入肉桂醛并使其浓度分别为0，MIC，10×MIC，最终使离心管总体积为5 mL，将其置于25 °C、150 rpm条件下孵育2 h；

（4）在所述步骤（3）中的离心管中加入含0.1%甲酸的乙腈-水（4:1，v/v）提取液5 mL，旋涡混合1 min，150 rpm室温振荡提取30 min；

（5）在所述步骤（4）中离心管中加入1.0 g MgSO₄和0.4 g NaCl，旋涡混合1 min，于4 °C、4000 rpm条件下离心10 min；

（6）取所述步骤（5）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析。

5.一种如权利要求1所述抑制链格孢菌生长及其体内真菌毒素积累的方法，其特征在于：利用肉桂醛降解葡萄果实中的链格孢毒素，此方法包括如下步骤：

（1）用手术刀将权利要求3中所有葡萄果实的腐烂部位切下，置于研钵中研磨均匀，并用无菌纱布过滤；

（2）将所述步骤（1）中滤液分为3组，每组3个重复，每个重复离心管中加入1.5 mL滤液，第1组每个离心管中加入肉桂醛并使其浓度为0.2 μL/mL，第2组每个离心管中加入肉桂醛并使其浓度为2.0 μL/mL，第3组不加肉桂醛作为对照组；

（3）将所述步骤（2）中离心管置于25 °C、150 rpm振荡培养箱中处理48 h；

（4）在所述步骤（3）中的离心管中加入含0.1%甲酸的乙腈-水（4:1，v/v）提取液1.5 mL，旋涡混合1 min，150 rpm室温振荡提取30 min；

（5）在所述步骤（4）中离心管中加入0.6 g MgSO₄和0.2 g NaCl，旋涡混合1 min，于4 °C、4000 rpm条件下离心10 min；

（6）取所述步骤（5）中上清液过0.22 μm有机滤膜，滤液经HPLC分析。