[发明专利]一种FFPE样本circRNA高通量测序文库的构建方法在审

申请号：	201810354803.5	申请日：	2018-04-19
公开（公告）号：	CN108546700A	公开（公告）日：	2018-09-18
发明（设计）人：	丁向明;孙萍;刘明;李杰;申健	申请（专利权）人：	广州密码子基因科技有限公司
主分类号：	C12N15/10	分类号：	C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
代理公司：	广州新诺专利商标事务所有限公司 44100	代理人：	张玲春
地址：	510663 广东省广州市高新技术产业开发***	国省代码：	广东;44
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摘要：
搜索关键词：	样本测序文库高通量构建去除福尔马林高通量测序提取总RNA 分离线性石蜡包埋石蜡切片文库构建效率低等磁珠捕获文库需求量耗时损伤残留
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【权利要求书】：

1.一种FFPE样本circRNA高通量测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从石蜡切片中提取总RNA；

(2)将样本RNA加上一段PolyA尾；

(3)Oligo dT磁珠捕获分离线性RNA；

(4)进一步去除残留的线性RNA；

(5)构建circRNA高通量测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述石蜡切片为福尔马林固定石蜡包埋的组织样本；所述提取总RNA采用提取试剂盒QIAGEN miRNeasy FFPE Kit。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，所述加polyA尾采用polyA聚合酶法；具体为在去除核酸酶的PCR管中加入总RNA、poly(A)聚合酶缓冲液、E.coli poly(A)聚合酶、ATP，混匀，瞬离，37℃，反应30min。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，所述Oligo dT磁珠捕获分离线性RNA具体为用Oligo dT磁珠捕获分离样品RNA中带有polyA尾的线性RNA；所述OligodT磁珠捕获带polyA尾线性RNA采用梯度变温法。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述梯度变温法具体为，将Oligo dT磁珠与带polyA尾线性RNA混合杂交，其反应条件为在68℃的温度下杂交5min，然后以0.1℃/s的速度将温度缓慢降至45℃，在45℃保持5min，再以0.1℃/s的速度将温度缓慢降至25℃，并在25℃保持5min。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，所述Oligo dT磁珠捕获分离线性RNA还包括分离线性RNA后用VAHTS RNA Clean Beads磁珠回收circRNA。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(4)中，所述进一步去除残留线性RNA采用RNase R消化法；具体为加入RNase R、RNase R Reaction Buffer(10×)，混匀，瞬离，反应10-30min，反应的温度为37℃。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：步骤(5)中，所述构建circRNA高通量测序文库包括以下步骤：

(Ⅰ)RNA片段化；

(Ⅱ)逆转录合成双链cDNA，并进行磁珠纯化；

(Ⅲ)末端修复、3’末端加A、连接接头，并进行磁珠纯化；

(Ⅳ)PCR扩增，并进行磁珠纯化。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：步骤(5)中，所述构建circRNA高通量测序文库所用纯化磁珠为Ampure XP磁珠。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：

步骤(Ⅰ)中，所述RNA片段化为加入Fragment,Prime and Elute Buffer(2×)，混匀，热盖温度为105℃，反应温度为85℃，反应时间5min；

步骤(Ⅱ)中，所述磁珠纯化采用1.8×磁珠；

步骤(Ⅲ)中，所述磁珠纯化为两步法纯化；所述两步法纯化具体为，先加入1.0×磁珠缓冲液进行纯化，再用0.60×/0.20×磁珠筛选出合适大小的目的片段；