[发明专利]一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法

权利要求书

1.一种超声波介导的秋水仙素加倍粳稻染色体的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、水稻种子的灭菌及萌动处理；

步骤2、采用超声波辅助秋水仙碱处理水稻萌动种子，获得染色体加倍的水稻苗；将制备好的露白水稻种子在无菌操作台中，用镊子转移到含有超声处理培养液I的三角瓶中，并铝箔将三角瓶瓶身完全遮盖，在冰水浴中孵育，随即进行超声波处理；完成上述处理后，将溶液去除，加入常温的超声处理培养液II超声处理；处理后，用无菌水反复冲洗3-6次，最后用超声处理培养液III处理水稻种子，然后，将种子用无菌水取出反复冲洗3-6次，并在筛选培养基I上进行光照培养，直到水稻幼苗表现为茎芽膨大，且略出现绿色；继续培养12-15天，期间淘汰出现的白化苗和快速伸长的水稻苗；

所述的超声处理培养液I的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液I的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100-15:100ml/粒，添加超声处理培养液I时的孵育时间为3-8min，超声波处理功率为90-180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行12组循环；超声波发生探头的直径为10mm；超声处理培养液II的组成如下：KCl 0.75g，蔗糖35g，水解酪蛋白2g/L，脯氨酸1.72g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L，超声处理培养液II的用量与制备好的露白水稻种子的用量比为10:100-20:100ml/粒，添加超声处理培养液II时的超声波处理功率为90-180W，处理方式为超声处理5s，间隔5s，进行6组循环；超声波发生探头的直径为10mm；超声处理培养液III的组成如下：KCl 0.75g，秋水仙碱0.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；添加超声处理培养液III时的处理时间为72h，期间每隔24h更换一次超声处理培养液III；所述的筛选培养基I的组成如下：KCl 0.15g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；光照培养温度为21-31℃；光照培养时间为20-28h；在筛选培养基I上继续培养时间为12-15天；

步骤3、将步骤2得到的水稻苗转移到筛选培养基II上继续培养，直到幼苗逐渐生根完成即进行移栽；所述步骤3中的筛选培养基II的组成如下：KCl0.75g，琼脂7.5g，余量为水，pH5.8，以上体积总量为1L；在筛选培养基II上继续培养时间为12-15天。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述的步骤1中的水稻种子的灭菌及萌动处理具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、精选水稻种子，在超净工作台中将其置于无菌三角瓶中；首先加入酒精，进行快速润洗，随后迅速将酒精倒出，并立即用无菌水冲洗3次；然后，向盛有水稻种子的三角瓶中加入H₂O₂浸泡，期间摇晃三角瓶几次以便充分灭菌；最后，用无菌水反复冲洗水稻种子3-4次；

步骤1.2、向步骤1.1处理后的盛有水稻种子的三角瓶中加入赤霉素的无菌水溶液，用透气的封口膜封口后，置于恒温培养箱内避光培养，然后用无菌水清洗种子3次以上；随后，向三角瓶中加入无菌水，继续在恒温培养箱内避光培养，直至种子露白。

3.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述的水稻种子为吉农大878。

4.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述步骤1.1中的酒精体积浓度为75％，酒精的用量与水稻种子的用量比例为10:100-20:100ml/粒，酒精的润洗时间不超过40秒；H₂O₂的体积浓度为10％，H₂O₂的用量与水稻种子的用量比例为20:100-30:100ml/粒，H₂O₂的浸泡时间为10-20min。

5.根据权利要求2所述的生产方法，其特征在于，所述步骤1.2中的赤霉素的质量浓度为0.1％，赤霉素的用量与步骤1.1中无菌水处理后的水稻种子的用量的比例为10:100-20:100ml/粒，添加赤霉素的培养时间为10-15h，添加赤霉素的培养温度为25-35℃；无菌水的用量为10:100-20:100ml/粒水稻种子，添加无菌水的培养温度为25-35℃，添加无菌水的培养时间为8-36h。