[发明专利]运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法

说明书

本发明公开了一种运用流式细胞技术快速测定鲟鱼基因组大小的方法，包括如下步骤：一、选取基因组已知大小的鱼类作为标准对照；将所述标准对照及待测鲟鱼分别进行如下操作：尾静脉取血，将血液进行离心、PBS缓冲液洗涤、加入2％多聚甲醛溶液、加入透化剂、染色等处理，用流式细胞仪进行检测，分别得标准对照的荧光强度峰值P₂及待测鲟鱼的荧光强度峰值P₁；二、按照N₁＝N₂×P₁/P₂，获得待测鲟鱼的基因组大小；式中N₁表示待测鲟鱼基因组大小，N₂表示标准对照的基因组大小。采用本发明的方法，能在大规模基因组测序之前，对我国几种主要的鲟鱼养殖品种进行基因组大小的初步测定。

技术领域

本发明属于鱼类基因组学领域，具体指的是运用流式细胞技术对我国几种主要的鲟鱼品种基因组大小测定的方法。

背景技术

鲟鱼(Acipenser sturio Linnaeus)隶属硬骨鱼纲辐鳍亚纲软骨硬鳞总目鲟形目，包括鲟科和匙吻鲟科两科，其下共有6属26个种。鲟鱼是世界上现有鱼类最古老的种类之一，迄今已有2亿多年的历史，素有“水中活化石”之称。鲟鱼主要分布在北半球的北美洲大陆和欧亚大陆，我国现存8种，3种分布于新疆(西伯利亚鲟、裸腹鲟、小体鲟)，2种在黑龙江(达氏鳇、施氏鲟)，2种在长江(白鲟、达氏鲟)，1种在长江至珠江各河流及沿海(中华鲟)。鲟鱼肉质味道鲜美，营养丰富，鲟鱼卵富含大量蛋白质和不饱和脂肪酸，有其加工而成的鱼子酱更是被称为“黑色黄金”，在国际市场价格昂贵，销售走俏。但是，由于过度捕捞，污染及栖息地环境退化等原因致使世界范围内野生鲟鱼的数量急剧下降，大多数已被列为濒危物种。

为了满足人们对鲟鱼肉制品及鱼子酱日益增长的需求，自20世纪80年代中期开始，鲟鱼养殖业在全世界逐渐形成和扩大，我国也加入其中成为了世界鲟鱼养殖的重要生产国。目前，我国主要养殖品种有：施氏鲟、达氏鳇、俄罗斯鲟、西伯利亚鲟，以及达氏鳇和施氏鲟的杂交鲟。从鱼子酱的色泽和大小上看，达氏鳇或者杂交鲟的卵径较大，达3.0毫米以上，颜色为珍珠灰或灰黑色，为目前市场上高端的一种鱼子酱，但缺点是它们卵成熟都较晚，一般需要8-10年。从2009-2013年世界鱼子酱产量来看，西伯利亚鲟为产量最大的品种，占总产量的36.24％。鲟鱼子酱是欧美等发达国家的奢侈消费品，近年来由于捕捞产量稀少，养殖产量正在逐步增长的过程中，市场供应量还远未恢复到历史上鱼子酱消费的峰值，产量的不足导致国际市场价格昂贵。根据FAO贸易统计数据显示，近十余年来鲟鱼子酱价格整体呈上升趋势，在高位区间窄幅波动。

鲟鱼无论是野外生长还是人工养殖，其雄性和雌性的比例都接近于1:1，并且鲟鱼没有第二性征，外部特征不足以进行性别鉴定。但是，鲟鱼又是一个典型的单性养殖品种，两种性别的养殖价值具有极大的差距。雄鱼主要用于肉食，生产价值不高。雌鱼主要用于鱼仔酱生产，具有很高的附加值。目前国内市场上对鲟鱼性别鉴定主要采用微创手术法，技术人员对在割开鱼腹一道5cm宽的小口后，直接对性腺进行观察。采用该方法，有很多局限性：

①、极大增加了饲养成本。必须要等到鲟鱼饲养到一定大小(性腺肉眼可见)时才能观察，这对于希望尽可能早期地鉴别出雌性鲟鱼、用于鱼子酱生产的养殖户来说，大大增加了饲养成本和场地占用成本。据浙江地区一位饲养鲟鱼长达二十多年的养殖户介绍，养殖鲟鱼一般要到3龄以后才能进行性别鉴定，达氏鳇要到4龄(此时约有10kg左右，非常难抓捕) 鉴定。

②、增加了性别鉴定的成本。掌握此性别鉴定技术的人员缺少，鉴定所需要费用的市场价格垄断，成本高。一般鉴定费用是15元/条。一家中型养殖企业每年用于性别鉴定的费用高达20-30万元。

③、鉴定所开的切口有感染风险。由于该方法是有创观察，鲟鱼在手术后会影响进食3-4 个月。同时，为了避免感染，只能在每年12月份以后到次年4月前，气温偏低的时期内进行鉴定。这对不同时间饲养的鲟鱼又造成了一定饲养成本的浪费。