[发明专利]一种人类精液超快速冷冻保存体系

说明书

一种适用于人类精子的超快速冷冻保存体系，包括冷冻保护剂、冷冻方法和解冻方法，本发明提供的冷冻保存体系，适用于未处理的人类精液和经过优选后的人类精液，以及微量人类精液的冷冻，使用本发明所述的冷冻保护剂与人类精液充分混合后，采用本发明提供的冷冻方法进行冷冻保存，并且采用本发明提供的解冻方法复苏后，可以获得与普通冷冻方法更好的冷冻复苏率、精子活力和前向运动精子总数。具有适用范围广，操作简便和操作时间短的优点。

技术领域

本发明涉及细胞的冻存领域，尤其是人类精液保存技术领域，属于生物技术领域，具体为一种人类精液超快速冷冻保存体系。

背景技术

辅助生殖技术的进步，为发生率为10％-15％的不孕症患者提供了能够拥有健康后代的希望。在辅助生殖中，人类精液的保存是最为基本的常规操作技术之一，精液冷冻技术的不断提升，意味着可以应用于临床使用的精子数量和质量的提高，有利于优生优育，人类精液的冷冻保存是男性不育症治疗的有效操作之一。另一方面，近年来，伴随着男性的生育年龄推后、环境影响等原因，男性精液质量持续下降，人类精液的冷冻保存为男性生育力的保存提供了强有力的保障。目前衡量人类精液冷冻质量的主要指标为精子冷冻复苏率，影响精子冷冻复苏率的主要因素分为精液自身因素和非自身因素，非自身因素主要包括实验室因素(包括冷冻保护剂、冷冻方法、冷冻载体、复苏方法等)和其他因素(季节因素、禁欲时间等)。精液自身因素和季节因素等属不可控因素，而本发明在可控的范围内提供了一种超快速的冷冻方法，优化了传统的人类精液冷冻保存方法，并且可以用于冻存优选处理后的精液和微量精液。

发明内容

本发明提供了一种人类精液的超快速冷冻保存体系，与传统的冷冻保存体系相比，降低了冷冻保护剂的生物毒性，克服了操作时间长和方法复杂等缺点。

一种人类精液的超快速冷冻保存体系，包括冷冻保护剂、冷冻方法和解冻方法。其特征在于，采用本发明的冷冻保护剂与人类精液充分混合后，采用本发明的冷冻方法进行冷冻保存，并且采用本发明提供的解冻方法复苏后，可以获得与传统冷冻方法更好的冷冻复苏率，精子活力和前向运动的精子总数。

为实现上述目的，本发明提供如下的方法体系：一种人类精液超快速冷冻保存体系，包括如下步骤：

A、配置冷冻保护剂，将配置好的冷冻保护剂，或者冻存的已配置好的冷冻保护剂置于37℃水浴箱中预热30分钟；

B、将精液与本发明提供的冷冻保护剂，按照1:1的比例充分混合。

C、取清洁容器，容器内加入清洁液氮。将步骤B中混匀的精液与冷冻保护剂混合物在清洁液氮上方至少5厘米处，以每滴10-100微升的体积将混合物滴入清洁液氮中。

D、收集沉入清洁液氮中的凝固液滴，将其装入普通冻存管中，液氮中保存。

E、将普通精液培养基装入15毫升离心管，以35℃-42℃的温度预热培养基，作为解冻液。

F、将步骤D中的凝固液滴从普通冻存管中取出，投入预热后的解冻液中，晃动至完全解冻。

G、将解冻液和冻存精液混合物离心去除上清后，沉淀精子可以直接用于临床。

优选地，步骤A中所述的冷冻保护剂，其特征在于：含有糖类、人血清白蛋白、甘氨酸和双蒸水。保护剂组分均匀混合后，经过0.22微米的过滤器过滤后，可冻存于-20℃保存

优选地，步骤A中所述冷冻保护剂含有的糖类可以是葡萄糖，蔗糖或者海藻糖之一。

优选地，步骤A中所述冷冻保护剂若使用葡萄糖配制，葡萄糖的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.045克-0.108克。

优选地，步骤A中所述冷冻保护剂若使用蔗糖配制，蔗糖的含量为每1毫升冷冻保护剂含有0.086克-0.205克。