[发明专利]一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）脱细胞基质膜（ECM膜）的制备：

a.将种子细胞种植于培养皿中，加入条件培养基或成骨诱导培养基，培养至细胞外基质分泌并铺满皿底；其中所述种子细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、成纤维细胞、成骨细胞中的任意一种；

b.在步骤a中细胞外基质培养好之后，取出细胞培养皿，弃去培养基，用磷酸盐缓冲（PBS）液轻柔冲洗2～3遍，然后往细胞培养皿中加入质量百分比为0.1%~10%的去污剂在36~38 °C下处理60~120min溶解细胞膜及核膜之后，再次使用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗2～3遍；

c.在步骤b中冲洗完成之后，再往细胞培养皿中加入脱氧核糖核苷酸酶质量百分比为0.5%~1%、核糖核酸酶质量百分比为0.05%~0.1%的PBS溶液在36~38 °C下处理2～3小时分解产物中残留的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸链；最后用磷酸盐缓冲（PBS）液轻柔冲洗2～3遍，即得脱细胞基质膜；

（2）多孔三维支架材料的制备：利用天然聚合物制成质量分数为1～5 wt％的均质凝胶溶液，然后加入凝胶溶液质量百分比为0%~50%的交联剂交联8～24h，交联完成后放入-20℃～ -40℃的低温冰箱中预冻4～24h，最后通过冷冻干燥后形成三维多孔支架；其中所述天然聚合物包括胶原蛋白、明胶、纤维素、海藻酸盐、透明质酸、水溶性壳聚糖、丝素蛋白中的任意一种或多种；所述溶剂为水或浓度0.01%~1%的乙酸溶液；

（3）将步骤（1）中制备的ECM膜在培养皿中展开至平铺于皿底，然后将步骤（2）制备的三维多孔支架进行环氧乙烷消毒后放入ECM膜中央，并在无菌环境下使用ECM膜将三维多孔支架完全包覆；其中所述ECM膜的面积为三维多孔支架表面积的3～10倍；

（4）将包覆有ECM膜的三维多孔支架置入-20～-80℃的条件下冷冻24h-48h后，采用冷冻干燥法干燥得到ECM膜复合骨修复材料。

2.根据权利要求1所述的一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的步骤a中，种子细胞培养的条件为温度36.5~37.5°C、CO2水平4.5~5.5%、pH值7.2-7.4的培养箱中培养3～28天。

3.根据权利要求1所述的一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料的制备方法，其特征在于所述步骤（1）的步骤a中条件培养基的配方为：DMEM质量百分比80%～90%、小牛血清质量百分比10%～20%、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，L-抗坏血酸20~100 ug/mL；所述成骨诱导培养基配方为：DMEM质量百分比80%～90%、小牛血清质量百分比10%～20%、青霉素100U/mL、链霉素100μg/mL，L-抗坏血酸20~100 ug/mL, β-磷酸甘油10mmol/L、地塞米松100nmol/L。

4.根据权利要求1所述的一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）的步骤b中的去污剂包括Triton X-100，十二烷基硫酸钠，3-[7] -1-丙磺酸，Tween20中的任意一种或几种混合。

5.根据权利要求1所述的一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料的制备方法，其特征在于所述步骤（1）的步骤c中含有脱氧核糖核苷酸酶和核糖核酸酶的PBS溶液具体是在PBS溶液中添加0.1~ 1mg/ml的脱氧核糖核苷酸酶，0.001~0.1 mg/ml 的核糖核酸酶，50~100 mmol/L Tris-HCl，1~100 mmol/L MgCl₂。

6.根据权利要求1所述的一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的交联剂为质量分数为0%~50%碳二亚胺，京尼平，戊二醛，钙离子中的任意一种。

7.根据权利要求1所述的一种组装型细胞衍生细胞外基质膜复合骨修复材料的制备方法，其特征在于所上步骤（2）和步骤（4）中的冷冻干燥温度为-40℃~-50℃，干燥时间为3~24h。