[发明专利]不对称花青素染料及其应用

说明书

本发明提出了一种不对称花青素染料结构的化合物，具有化学结构通式(I)。该化合物本身没有荧光，但与RNA复合时可以产生强烈的荧光信号，并且荧光信号强度与RNA浓度成正比，且对RNA具有高度选择性。因此，利用该化合物可以简单快速测定生物样品中RNA的浓度。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地说是涉及一类不对称花青素染料及其应用。

背景技术

在生物样品检测中，荧光染料因具有检测的高度灵敏度，广泛应用于该领域。此法通过与生物样品中的某个特定靶点结合，协助研究者检出该靶点物质，并进行定量测定。核酸(如DNA和RNA)参与遗传信息代代传递的过程，维持生命有机体的正常功能，因此常常成为人们研究的对象和焦点。而荧光染料因为能够与核酸分子特异结合，形成具有高度荧光性的复合物，所以是开展此类研究的有利工具。这类染料可用于检测各种状态下的DNA或RNA，包括溶液、电泳凝胶、印迹杂交、微阵列、死细胞或固定细胞以及活细胞中的核酸分子。

目前，市面上售有多种染料用于核酸物质的检测。而不对称型花青染料自从由Brooker等人(J.AM CHEM SOC.64,199(1942).)引入之后，许久才被广泛周知能用于DNA的检测。而另一种商用染料噻唑橙(Thiazole Orange)则被充分应用于幼红细胞或网织红细胞的定量分析，详见Lee等人申请的美国第4,883,867号专利(1989)，以及Lee等人撰写的《噻唑橙：用于网织红细胞分析的一种新型染料》(CYTOMETRY，7,508(1986))。然而，甲基橙法的局限性在于，它对核酸物质的灵敏度较低。另一种应用最为广泛的核酸染色剂是溴化乙锭(Ethidiumbromide)，在市面上有大量供应商销售这款染色剂。然而，溴化乙锭同时也是一种诱变剂，要求使用者在应用时特别注意，避免与染色剂溶液接触，同时要求进行特殊处理，做好废弃物处理工作(M.J.Waring,J.Mol.Biol.I 13,269(1965)；McCann et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72,5135(1975)；and Fukunaga et al.,Mutation Res.127,31(1984))。此外，可用于dsDNA检测的染色剂PicoGreen、可用于单链DNA定量检测的染色剂OliGreen，以及可用于RNA在溶液中的定量检测的染色剂RiboGreen都由Invitrogen公司销售。Invitrogen公司还销售一种选用于DNA、DNA凝胶染色和qPCR定量检测的染色剂SYBRGreeen I，以及对DNA和RNA染色具有高度灵敏性的染色剂SYBR Gold。上述染色剂分别在美国专利第5,436,134、5,658,751和5,863,753号中有详细说明。

然而，以上染色剂水溶性低，须在有机溶剂(如DMSO或DMF)中预溶解；同时，它们在水溶液中稳定性不足，须在24小时之内使用，以免丧失灵敏度。还有一种不对称花青染料SYBR Safe，它诱变性低，可作为SYBR Green I和溴化乙锭的替代品，亦由Invitrogen公司销售。该染料在美国专利第7,727,716和7,977,057中有详细说明。不过，这种替代染料的水溶性和灵敏度不够理想。

发明内容

本发明针对现有技术中现有的花青染料结构不稳定、水溶性差、灵敏度低等缺点，进行结构改造，开发了一类结构新颖对核酸检测具有高度选择性和灵敏度的不对称花青素染料结构的化合物。

一种不对称花青素染料结构的化合物，具有如下化学结构通式(I)：

其中，

X是O、S或C(CH₃)₂；

t和s中的每一个是从0到4的整数；

R¹和R⁶各自独立地为氢、羧基、磺基、磺酰胺、卤素、CN或烷氧基；