[发明专利]基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV‑3抗体的间接ELISA检测方法及应用。该检测方法中涉及一种试剂盒，所述试剂盒以VP2或VP4重组蛋白为包被抗原。本发明的检测方法特异强，灵敏度高、重复性好、检测方便快捷，与细胞中和试验符合率较高，可为DHAV‑3的检测提供一种途径，也为该病的后续研究以及流行病学调查奠定基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法及应用。

背景技术

鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)是一种无囊膜包裹的单股正链RNA病毒，基因组全长约7.7kb，其基因组仅一个开放阅读框(Open readingframe，ORF)，共编码3种结构蛋白和9种非结构蛋白，主要有3个基因型(DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3)，其中DHAV-2主要在台湾等地区流行，我国大陆地区未见报道，而DHAV-1和DHAV-3在我国普遍流行，且存在混合感染的情况，为该病的诊断治疗增加了难度。

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法是实验室诊断方法中常用的实验手段，也是一种可以用于临床样本检测的方法，既可以用于抗体的检测也可以用于抗原的检测，该方法操作简单，使用方便，可用于DHAV的诊断。目前，可用于DHAV诊断的ELISA检查方法，包括有全病毒包被ELISA法、卵黄抗体ELISA法、PCR-ELISA法、酶标抗原Dot-ELISA法等。然而，这些方法具有取材不易、操作繁琐、设备要求高、价格昂贵、运输不便、流程繁多、使用场所具有局限性、专业知识需求等问题，因此在临床生产中不利于推行使用，如全病毒包被法所需的纯度较高的病毒粒子，需要培养病毒且经过一系列的离心、提纯等操作，每个步骤对温度要求较高，需尽量在低温环境下完成，纯化过程中需小心谨慎，否则病毒纯度很难保证，会影响检测效果。此外，DHAV是RNA病毒，不稳定、易降解，低温保存不利于运输。

VP2和VP4在小RNA病毒中保守性好，不同血清型病毒间差异小，两者蛋白表面均含有抗原表位，可以特异性结合相应抗体，且VP2蛋白表面存在的IgM的抗原决定簇可为后续DHAV-3早期诊断研究奠定基础。目前，尚未见任何有关用VP2或VP4进行DHAV-3诊断的报道，关于DHAV-3的诊断主要集中在免疫组化法、荧光定量RT-PCR法等，虽然说这些方法的诊断准确性也比较高，但是也存在许多缺点。例如，免疫组化法，需要用纯化的病毒粒子作为抗原来获得超免血清，再用该血清作为抗体检测DHAV-3抗原，在这一过程中病毒粒子的获得、纯化以及超免血清的获取均费时费力，且还需特殊设备的支持，因此，资金需求量大，实验周期长。此外，制作切片时，前期样品处理时间比较长，在实际生产过程中会耽误疾病的诊断。荧光定量RT-PCR虽然可以比较准确的检测出DHAV-3病原，但是由于这种方法需要特定的PCR仪辅助完成，而该仪器价格昂贵，且生产实践中基层单位一般都没有该仪器，因此使用地点具有局限性。

发明内容

有鉴于此，本发明针对待检样本处理周期长、诊断地点具有局限性、操作繁琐、实验流程复杂、原材料不稳定易降解的问题，提供了一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒以VP2或VP4重组蛋白为包被抗原。

进一步地，所述VP2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述VP2重组蛋白以包涵体的形式存在，所述VP4重组蛋白以上清的形式存在。

进一步地，所述试剂盒包括酶标二抗，所述酶标二抗为HRP标记的抗鸭IgG。

本发明还公开了一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：