[发明专利]培养基及其在中央记忆型T淋巴细胞培养中的应用

说明书

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及培养基及其在中央记忆型T淋巴细胞培养中的应用。本发明提供的培养基由基础培养基、mTOR抑制剂、白细胞介素‑2、白细胞介素‑7、白细胞介素‑12、白细胞介素‑15、白细胞介素‑1a、Anti‑CD3抗体和Anti‑CD28抗体组成。本发明培养基和培养方法可以提供高数量和比例的中央记忆型T淋巴细胞，实验表明，使用本发明提供的培养基可以扩增TCM达约100倍，在培养的20天中，第20天细胞数量最多，而第12天(样本B)TCM细胞的纯度最高。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及培养基及其在中央记忆型T淋巴细胞培养中的应用。

背景技术

免疫系统能够帮助机体抵抗病菌感染和清除肿瘤，以维持机体内环境的稳态，其发挥作用的基础在于免疫细胞。免疫细胞包括抗原递呈细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞等，在中枢免疫器官和外周免疫器官均有分布。中枢免疫器官一般指骨髓和胸腺，分别是B细胞和T细胞发育的场所；外周免疫器官一般指脾脏、扁桃体、淋巴结等，是B细胞和T细胞驻守和巡视的场所。免疫系统稳态的紊乱会导致多种疾病的产生。免疫缺陷，如先天性重症联合免疫缺陷、HIV感染引发的T细胞死亡以及药物处理导致免疫细胞的清除，均会大大增加机体机会感染的概率，严重者引发死亡。免疫机能亢进则会引发自身免疫疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等。因此，维持机体免疫系统的稳态对于机体的正常生理功能和健康至关重要。

肿瘤细胞是一类恶性无限增殖的细胞，正常情况下会被机体免疫系统识别并杀死。肿瘤细胞一般过量表达机体正常细胞不表达或者低表达的表面抗原，因而会被抗原递呈细胞识别，并激活T细胞分化产生抗原特异性的效应T细胞，效应T细胞迁移至病灶处杀死肿瘤细胞。初次免疫反应发生后，90-95％的效应T细胞相继死亡，剩下的细胞是中央记忆T细胞(Central Memory T Cell,TCM)和效应记忆T细胞(Effector Memory Cell,TEM)，它们会在相同抗原的再次刺激下迅速增殖分化产生效应T细胞，快速消灭肿瘤。

一般地，发挥杀瘤作用的细胞多为CD8+细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic TLymphocyte,CTL)，主要通过T细胞受体(T cell receptor,TCR)与靶细胞的肿瘤抗原和HLAI型抗原相结合，成功捕捉靶细胞，然后通过两种方式杀死靶细胞：一种方式是CTL分泌释放细胞毒素，如穿孔素、颗粒酶以及颗粒酶溶解素等，细胞毒素进入靶细胞胞质后激活Caspase级联反应，引发靶细胞凋亡；另一种方式是通过CTL的表面配体FasL与靶细胞表面的Fas相结合，通过招募死亡诱导讯号复合体(Death Inducing Signal Complex,DISC)，诱发Caspase级联反应，引发靶细胞凋亡。CD4+T细胞在肿瘤免疫中主要发挥辅助作用。CD4+T细胞经靶细胞活化后，通过分泌TNFa,IFNγ等炎症因子招募巨噬细胞侵入肿瘤病灶，帮助CTL杀伤肿瘤细胞，且对CD8+Tcm的形成不可或缺。

肿瘤细胞有多种方式逃避免疫监视而逐步发展成为难以治愈的癌症。首先，有些肿瘤细胞因为TAP或者B2M基因突变导致人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)表达量偏低或者消失，致使CTL不能有效辨别并结合肿瘤细胞。另外，肿瘤细胞表达VISTA、TIM3、LAG3、PD-1等表面抗原，与CTL相应受体结合后能够激发免疫抑制效果，使CTL瘫痪，无法释放细胞毒素。再者，肿瘤细胞分泌TGFb、CSF-1、adenosine等因子吸引或激活调节性T细胞、二型巨噬细胞和髓系来源的抑制细胞(myeloid derived suppressive cells,MDSC)等，使CTL凋亡或衰竭。