[发明专利]一种体外扩增I型天然细胞毒性淋巴细胞ILC1/NK的方法

说明书

本发明公开了一种体外扩增I型天然细胞毒性淋巴细胞ILC1/NK的方法。本发明提供了一种体外扩增ILC1/NK细胞的方法，为用破骨细胞作为滋养层，联合使用抗CD16抗体和白介素‑2扩增ILC1/NK细胞。本发明的实验证明，本发明的方法活化扩增的ILC1/NK细胞同时具有很强的分泌干扰素γ和裂解杀伤肿瘤干细胞的功能，其裂解杀伤肿瘤干细胞例如MiaPaCa‑2的能力比不使用滋养层法、使用辐射的外周血单核细胞(PBMC)方法扩增获得的ILC1/NK细胞、以及癌细胞系NK92细胞(ATCC，CRL‑2407)等的能力平均高18倍左右。

技术领域

本发明属于免疫生物技术领域，具体是指使用非瘤细胞即破骨细胞和白介素-2在体外扩增活化I型天然细胞毒性淋巴细胞(ILC1/NK)的方法，称为Pingan APD法；具体涉及一种体外扩增I型天然细胞毒性淋巴细胞ILC1/NK的方法。

背景技术

CD3^-CD56⁺I型天然毒性淋巴细胞(ILC1/NK，Nicholson等Molecular Immunology(2017),https://doi.org/10.1016/j.molimm.2017.12.002)是循环血中的一种淋巴细胞，不需要病原激活直接识别变异细胞/肿瘤细胞和病原感染的细胞进行裂解杀伤，也具有连续杀伤的能力，因此又称为天然免疫连环杀手。在体内执行巡逻的ILC1/NK细胞不断地与其他细胞接触，是否杀伤被接触到细胞则取决于ILC1/NK自身表面的活化型抗体和抑制型抗体的动态平衡。活化型抗体识别表达在肿瘤细胞和被病原感染细胞表面的分子从而被激活；抑制型抗体则是监控ILC1/NK细胞杀伤行为的。大多数健康的细胞表面表达MHC I抗原标记“自体”。抑制型抗体识别表示“自体”的标示MHC I来抑制ILC1/NK对“自体”实施杀伤。病原感染的细胞和肿瘤细胞通常缺少“自体”标示的MHC I，被ILC1/NK识别后释放包含穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒导致靶细胞被裂解杀死。因此，ILC1/NK细胞是对抗病原感染和消除肿瘤细胞的重要免疫细胞。肿瘤细胞的表面的MHC 1表达降低甚至消失，ILC1/NK细胞与其接触就会被活化；或者肿瘤细胞表面的抗原与ILC1/NK细胞的活化型受体结合，活化ILC1/NK的信号超过了抑制信号从而激活ILC1/NK细胞。另外，ILC1/NK细胞表面的FcyRIII又称CD16可与肿瘤抗原特异性抗体Fc片段结合，介导其ILCs-1细胞识别并杀伤表达这种Fc的肿瘤细胞，这种杀伤作用又被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。同时，ILC1/NK细胞还可以产生大量的细胞因子，来调节活化其他免疫细胞如巨噬细胞和树突细胞来增强免疫应答。总之，ILC1/NK细胞的裂解杀伤作用主要包括：(1)释放穿孔素和颗粒酶并激活caspase通路诱导靶细胞凋亡；(2)通过Fas/CD95的配体和肿瘤坏死因子相关性配体TRAIL通路的级联反应诱导靶细胞凋亡；(3)细胞因子如活化ILC1/NK细胞分泌大量的干扰素、肿瘤坏死因子、白介素15、白介素8等介导的细胞毒杀伤；(4)ADCC杀伤作用。

活化的ILC1/NK细胞的肿瘤靶细胞是未分化的肿瘤细胞，又称肿瘤干细胞。化疗药物和靶向药物等手段对分化的肿瘤细胞敏感，对肿瘤干细胞耐受。虽然靶向药物在确认突变靶点匹配时在初期对肿瘤的抑制非常有效，由于肿瘤细胞突变的几率很高，靶向药物会很快对肿瘤耐受而失效。手术治疗固然可以将癌灶切除，但是，残留的肿瘤干细胞在一定时期内会引起大多数的癌症患者复发肿瘤。

目前，癌症治疗领域仍在寻找有效的治疗癌症、消除癌症转移、复发的方案。众所周知，肿瘤干细胞的存在以及对化疗药物、靶向药物和放疗的不敏感是癌症复发、转移的主要因素。急需开发一种具有高效杀伤分化的或未分化的肿瘤细胞的新型生物免疫疗法。